本文選題：腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)化酶 + 酶活性　； 參考：《華中科技大學(xué)》2009年博士論文

【摘要】： 第一部分底物肽-HPLC原位測(cè)定跨膜TACE活性方法的建立 【背景】 腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)換酶(Tumor necrosis factor-alpha converting enzyme,TACE,也即ADAM17)是將膜型腫瘤壞死因子α(mTNF-α)轉(zhuǎn)換為可溶性腫瘤壞死因子α(sTNF-α)的主要分泌酶,同時(shí)也介導(dǎo)許多其它細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體的加工脫落,在炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、增殖分化調(diào)節(jié)以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等眾多生理病理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。但TACE如何特異性識(shí)別底物分子,如何進(jìn)行活性調(diào)節(jié)和控制等,都是研究者們一直感興趣卻又沒(méi)能徹底解決的問(wèn)題。回答這些問(wèn)題首先需要一種快速、準(zhǔn)確且重復(fù)性好的酶活性檢測(cè)方法,來(lái)實(shí)時(shí)觀測(cè)研究過(guò)程中的酶活性改變。常用的測(cè)定酶活性的方法主要有兩類:一是以檢測(cè)酶-底物反應(yīng)產(chǎn)物為基礎(chǔ)的方法,如底物肽-HPLC法、底物膠電泳法、MTT細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)等,另一類是以檢測(cè)酶表達(dá)量為基礎(chǔ)的輔助方法,如酶聯(lián)免疫吸附(ELISAs)、Western Blot、流式細(xì)胞術(shù)(FACS)、間接免疫熒光等。前者主要應(yīng)用在酶活性調(diào)節(jié)研究上,如酶活性調(diào)節(jié)機(jī)制、酶抑制劑藥物等,后者則主要輔助探索酶活性改變的影響機(jī)制。 底物肽-HPLC法是將人工模擬底物肽與高效液相色譜技術(shù)(HPLC)結(jié)合起來(lái)的一種快速準(zhǔn)確且適合高通量篩選的酶活性檢測(cè)方法。即根據(jù)底物分子中被酶特異性識(shí)別和水解的特定序列,人工合成具有底物功能的寡肽,能夠被酶的活性中心識(shí)別、結(jié)合和特異性水解,且不易被其它蛋白酶降解。建立酶與底物模擬肽的催化水解反應(yīng)體系,并利用HPLC定量分析反應(yīng)產(chǎn)物的變化,從而評(píng)價(jià)酶對(duì)特定底物的專一性和催化活性。如果用紫外或熒光基團(tuán)標(biāo)記底物肽分子,可以將檢測(cè)限降至納克級(jí),提高檢測(cè)靈敏度。此方法直接監(jiān)測(cè)酶催化水解底物的產(chǎn)率變化,是最直觀最有力地評(píng)價(jià)酶活性的指標(biāo)。目前底物肽-HPLC法以其快速準(zhǔn)確,重復(fù)性好,靈敏度高,適合高通量藥物篩選研究等優(yōu)勢(shì),在酶活性研究中得到廣泛的應(yīng)用。 【目的】 1.建立檢測(cè)TACE活性的TNFα模擬底物肽-HPLC方法,并通過(guò)與底物膠電泳、MTT細(xì)胞毒法、FACS等方法的比較,對(duì)該技術(shù)進(jìn)行評(píng)估; 2.應(yīng)用所建立的底物肽-HPLC方法研究人重組TACE(rhTACE)對(duì)底物肽的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),通過(guò)K_m,V_(max),k_(cat)/K_m等動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定,評(píng)價(jià)rhTACE的底物專一性和催化活性,并通過(guò)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比驗(yàn)證方法的可行性。 3.應(yīng)用所建立方法進(jìn)行活細(xì)胞膜TACE活性研究。 【方法】 1.模擬TACE底物TNFα水解位點(diǎn)附近的氨基酸序列,合成高純度(95%)帶紫外標(biāo)記的底物肽段Dnp-SPLAQAVRSSSR-NH_2; 2.優(yōu)化適合分離底物肽及TACE水解后的裂解小肽的色譜操作條件,包括紫外吸收波長(zhǎng)、梯度洗脫條件、流動(dòng)相流速、進(jìn)樣量等色譜參數(shù)的優(yōu)化和選擇。 3.優(yōu)化TACE-底物肽反應(yīng)體系,包括反應(yīng)緩沖體系的選擇,最適pH值,溫度的影響,反應(yīng)終止條件等。 4.TACE-底物肽酶促動(dòng)力學(xué)研究。包括確定反應(yīng)初始速度階段所需的酶量,在一定酶量下不同底物肽濃度與反應(yīng)初速度之間的關(guān)系,并根據(jù)米氏方程利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法求出動(dòng)力學(xué)常數(shù)K_m,V_(max),k_(cat)/K_m。 5.建立U937,HEK293細(xì)胞與底物肽的微升級(jí)反應(yīng)體系,HPLC法觀測(cè)細(xì)胞數(shù)量改變(即酶濃度的改變)對(duì)一定濃度底物肽水解反應(yīng)的影響,以及細(xì)胞酶激活劑與抑制劑對(duì)酶活性的影響。 6.多方法對(duì)比評(píng)估:底物明膠電泳法測(cè)定金屬蛋白酶(MMP),rhTACE對(duì)底物明膠的水解活性;MMT法觀察受PMA和LPS刺激的細(xì)胞上清中的可溶性TNFα(sTNFα)對(duì)L929的細(xì)胞毒性:FACS法檢測(cè)LPS刺激后細(xì)胞膜上TACE分子的表達(dá)量的改變。對(duì)以上各方法的靈敏度,適用范圍作出評(píng)價(jià)。 【結(jié)果】 1.確定了TACE-peptide體系的反相色譜分析條件(M5): [1]C8反相色譜柱(4.6mm×50mm); [2]檢測(cè)波長(zhǎng)為350nm; [3]流動(dòng)相為A:20%乙腈+80%水,B:60%乙腈+40%水,含1%TFA; [4]梯度洗脫條件為100%A平衡5min,隨后在20min內(nèi)將100%A線性遞變?yōu)?00%B; [5]流動(dòng)相流速為0.8mL/min;進(jìn)樣量為10～15μl。 2.確定了TACE-底物肽反應(yīng)緩沖體系的組成:25 mM Tris-HCl(pH 8.5),2.5μM ZnCl_2,5%Glycerol;加入1%TFA終止酶解反應(yīng)。 3.確定了在反相色譜分析條件(M5)下純肽的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,用來(lái)校正HPLC實(shí)測(cè)的峰面積與真實(shí)濃度的關(guān)系。 4.確定了酶促反應(yīng)初速度階段所需的酶量:當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0μM時(shí),反應(yīng)初速度階段所需TACE的量應(yīng)≤1.5 ng/μl,所以在10～80μM底物肽反應(yīng)體系中,我們所加的TACE始終選擇為1 ng/μl。 5.測(cè)定了pH 8.5,溫度分別為25℃和37℃時(shí)TACE對(duì)底物肽的酶促反應(yīng)米氏常數(shù)K_m為62.84μM(37℃)和37.02μM(25℃),催化常數(shù)k_(cat)值為1.5407 s~(-1)(37℃)和0.5161 s~(-1)(25℃),專一性常數(shù)k_(cat)/K_m值為2.4×10~4 M~(-1)·s~(-1)(37℃)和1.4×10~4 M~(-1)·s~(-1)(25℃)。 6.HEK293細(xì)胞株穩(wěn)定表達(dá)TACE(ADAM17)及TNFα,但不表達(dá)其它基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP),可以減少反應(yīng)體系中的非特異性水解,是作為底物肽-HPLC法在細(xì)胞體系應(yīng)用的理想的細(xì)胞模型。在100μl的自然細(xì)胞反應(yīng)體系中,20min以內(nèi)幾乎檢測(cè)不到TACE產(chǎn)物峰;但使用金屬蛋白酶激活劑PMA和藥物(小檗堿)處理細(xì)胞后再與底物肽發(fā)生酶促反應(yīng),則可以在較短的反應(yīng)時(shí)間(≤20min)內(nèi)準(zhǔn)確檢測(cè)到TACE產(chǎn)物峰,并觀察到使用金屬蛋白酶抑制劑時(shí)產(chǎn)物峰面積減小,且都與處理時(shí)間和濃度呈線性變化關(guān)系。純酶體系和細(xì)胞體系的產(chǎn)物峰,均通過(guò)HPLC-MASS聯(lián)用分析得以證實(shí)。 7.底物明膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)LPS刺激后的U937細(xì)胞的MMP酶譜表達(dá)有明顯增加,但rhTACE的用量達(dá)50ng仍未能得到陽(yáng)性結(jié)果:MMT細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在LPS和PMA刺激下的HL-60和U937細(xì)胞產(chǎn)生sTNF-α的變化,發(fā)現(xiàn)刺激組的細(xì)胞上清對(duì)L929的殺傷率比對(duì)照組有明顯提高;FACS實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,LPS刺激對(duì)膜蛋白TACE的表達(dá)量沒(méi)有相應(yīng)顯著的變化。結(jié)果表明:底物膠電泳法不適合進(jìn)行TACE活性檢測(cè):MTT法步驟繁瑣,重復(fù)性差,不能嚴(yán)格定量分析:FACS法只能提供活性相關(guān)的輔助信息;而相比之下,底物肽-HPLC法能嚴(yán)格定量研究酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),更能對(duì)跨膜TACE實(shí)現(xiàn)原位活性測(cè)定。 【結(jié)論】 本文成功建立了底物肽-HPLC方法用來(lái)測(cè)定TACE活性,確定了TACE-底物肽體系的最佳反應(yīng)條件及底物肽與TACE裂解產(chǎn)物肽的最佳HPLC分離條件,并測(cè)定了TACE與底物肽的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)K_m、V_(max)和k_(cat)/K_m,均符合酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)行為。在使用同類方法測(cè)定金屬蛋白酶活性的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)中,k_(cat)/K_m值大多在10~4～10~5M~(-1)·s~(-1),與我們所測(cè)定的2.4×10~4 M~(-1)·s~(-1)(37℃)和1.4×10~4M~(-1)·s~(-1)(25℃)相符,這些數(shù)據(jù)充分證實(shí)了我們所建立的底物肽-HPLC方法測(cè)定TACE活性的可行性。首次嘗試將底物肽-HPLC測(cè)定TACE活性的方法應(yīng)用在活細(xì)胞體系,對(duì)細(xì)胞反應(yīng)體系作了優(yōu)化和改良,使微升體系的活細(xì)胞膜酶TACE活性的原位檢測(cè)成為可能,并得到了較理想的結(jié)果,這也是本文的重要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)之一。首次選用HEK293細(xì)胞作為反應(yīng)體系的細(xì)胞模型,并發(fā)現(xiàn)該模型可以有效簡(jiǎn)化裂解產(chǎn)物肽HPLC峰譜。酶激活劑和抑制劑對(duì)HEK293細(xì)胞膜酶TACE活性的調(diào)節(jié)可以通過(guò)HPLC圖譜上底物肽產(chǎn)物峰的面積變化得到直觀而有效的評(píng)價(jià)。 本方法在細(xì)胞體系上的應(yīng)用,彌補(bǔ)了底物明膠電泳的對(duì)底物需求量大,不能用于活細(xì)胞檢測(cè);MMT法的間接、步驟繁瑣、重復(fù)性差;FACS方法只能輔助提供酶活性信息等各方法諸多無(wú)法克服的缺點(diǎn),不僅能直觀準(zhǔn)確地反應(yīng)酶活性,還能進(jìn)行較大樣本對(duì)比分析,這將對(duì)進(jìn)一步探索細(xì)胞跨膜TACE活性調(diào)節(jié)機(jī)制及抑制劑的初步篩選提供重要的技術(shù)支持。 第二部分細(xì)胞膜的脂質(zhì)微環(huán)境對(duì)膜酶—TACE活性的調(diào)節(jié) 【背景】 脂筏是細(xì)胞膜脂雙層結(jié)構(gòu)的亞結(jié)構(gòu)域。脂筏內(nèi)膽固醇含量較高,比周圍質(zhì)膜的流動(dòng)性低,其主要功能是為膜蛋白分子的組裝提供了一個(gè)平臺(tái),便于它們的聚集和相互作用,并有利于蛋白質(zhì)形成有效的構(gòu)象。適當(dāng)?shù)哪懝檀己渴蔷S持脂筏穩(wěn)定的必要因素,膽固醇含量的降低將導(dǎo)致細(xì)胞膜的流動(dòng)性增加繼而導(dǎo)致脂筏解體,使處在脂筏上的某些脫落酶或其底物分子的構(gòu)象發(fā)生改變,相互接觸并發(fā)生水解,從而觸發(fā)細(xì)胞的各種生理、病理反應(yīng)。 為了探索在機(jī)體自然衰老過(guò)程中或在某些老年性疾病的病理過(guò)程中細(xì)胞膜微環(huán)境所發(fā)生的對(duì)應(yīng)改變以及這些改變對(duì)細(xì)胞功能的影響,從而為尋找相應(yīng)的對(duì)策及調(diào)節(jié)點(diǎn),以延緩衰老過(guò)程這也是本課題研究的目標(biāo)所在。其中,ADAM家族中的ADAM17、ADAM10、ADAM9等成員,由于對(duì)腦組織中的淀粉樣前體APP具有特異的水解加工作用,因此這類與APP加工有關(guān)的α-分泌酶的活性及變化,表達(dá)及調(diào)控都是研究的熱點(diǎn)之一。 已有眾多報(bào)道圍繞著脂類物質(zhì)含量對(duì)脂筏及細(xì)胞膜功能的影響,現(xiàn)已證實(shí)膽固醇含量改變對(duì)TACE的眾多跨膜底物如APP(amyloid precursor protein)、CD30、L-選擇素、L1黏附分子等的胞外結(jié)構(gòu)域脫落有影響,提示膜膽固醇含量的變化與TACE的活性之間可能存在某種聯(lián)系。使用物理性膽固醇剝奪劑甲基-β-環(huán)糊精(methyl-β-cyclodextrin,M~βCD)去除細(xì)胞膽固醇不影響細(xì)胞的其它生理生化過(guò)程,是目前常用的降低質(zhì)膜膽固醇含量的方法,質(zhì)膜中膽固醇含量的變化可以直接導(dǎo)致脂筏狀態(tài)的改變。利用與膜脂分子結(jié)合的熒光探劑測(cè)定細(xì)胞膜流動(dòng)性改變可以評(píng)價(jià)質(zhì)膜中脂筏的狀態(tài)。 小檗堿(berberine,BBR)是我國(guó)傳統(tǒng)中藥黃連素的主要活性成分,具有明顯的降膽固醇作用。BBR最初是作為清熱解毒藥和抗菌藥應(yīng)用于臨床,后來(lái)逐漸發(fā)現(xiàn)它具有降血糖、降血脂、抗血小板、抗老年斑、抗腫瘤等多種藥理作用,而上述疾病的發(fā)生發(fā)展都與TACE對(duì)膜底物分子的脫落加工有著緊密的聯(lián)系。BBR的這些藥理作用對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響,及其對(duì)細(xì)胞膜脂筏中TACE與底物分子的相互作用的調(diào)節(jié)等問(wèn)題都是研究的新課題,為此,本部分將作方法學(xué)和細(xì)胞模型體系的探討,并以TACE(ADAM17)為代表進(jìn)行膜結(jié)構(gòu)與功能的初步研究。 【目的】 1.建立基于FACS技術(shù)的細(xì)胞膜流動(dòng)性檢測(cè)方法。 2.研究M~βCD降低細(xì)胞膜膽固醇含量所帶來(lái)的細(xì)胞膜流動(dòng)性的改變以及TACE活性的變化,為膜流動(dòng)性與TACE活性之間的因果關(guān)系提供證據(jù)。 3.調(diào)查BBR對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性及TACE活性的影響。 4.從細(xì)胞膜流動(dòng)性的角度探討B(tài)BR對(duì)細(xì)胞膜TACE活性的影響機(jī)制。 【方法】 1.細(xì)胞膜流動(dòng)性檢測(cè)方法的建立: 用流式細(xì)胞儀(FACS)測(cè)定膜脂與熒光探劑MC540結(jié)合后的二維散點(diǎn)圖和頻數(shù)分布,檢測(cè)脂質(zhì)分子的堆積程度,進(jìn)而反映膜脂流動(dòng)性。 2.從兩方面弄清物理性剝奪細(xì)胞膜膽固醇后導(dǎo)致的膜流動(dòng)性變化: (1)鏡下觀察M~βCD處理HEK293和U937細(xì)胞后形態(tài)的變化; (2)用FACS法檢測(cè)M~βCD處理HEK293和U937細(xì)胞后膜脂質(zhì)分子的堆積程度的變化。 3.從兩方面評(píng)價(jià)M~βCD對(duì)TACE活性的影響: (1)用MTT細(xì)胞毒法研究M~βCD處理HEK293和U937細(xì)胞后上清中sTNFα的變化; (2)用所建立的底物肽-HPLC方法研究M~βCD處理后細(xì)胞-peptide反應(yīng)體系的反應(yīng)進(jìn)程產(chǎn)率變化。 4.調(diào)查不同濃度BBR處理HEK293和U937細(xì)胞不同時(shí)間后細(xì)胞膜流動(dòng)性的改變,證明BBR處理與細(xì)胞膜流動(dòng)性之間的聯(lián)系。 5.用上述方法調(diào)查TACE活性變化與BBR濃度與處理時(shí)間的關(guān)系,即用底物肽-HPLC方法研究BBR處理后細(xì)胞-peptide反應(yīng)體系的反應(yīng)進(jìn)程產(chǎn)率變化;用MTT細(xì)胞毒法研究細(xì)胞上清中sTNFα的變化,并與M~βCD及PMA處理組做對(duì)比,證明BBR處理與TACE活性之間的聯(lián)系。 6.用RT-PCR法研究BBR對(duì)HEK293和U937細(xì)胞的TACE mRNA的影響,排除調(diào)查BBR影響TACE活性的其它可能途徑。 【結(jié)果】 1.測(cè)膜流動(dòng)性方法建立:FACS檢測(cè)的二維散點(diǎn)分布圖和頻數(shù)分布圖均表明,當(dāng)細(xì)胞膜膽固醇被M~βCD物理性剝奪后,無(wú)論是懸浮U937還是貼壁HEK293細(xì)胞,均明顯向高熒光強(qiáng)度區(qū)域擴(kuò)散,且分布相對(duì)松散,這表明膜脂分子的體積增大,堆積程度更為疏松,提示細(xì)胞膜流動(dòng)性的增加,結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致,可以確定基于FACS的細(xì)胞膜流動(dòng)性檢測(cè)方法的可行性。 2.膜流動(dòng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果: (1)經(jīng)M~βCD處理過(guò)的HEK293細(xì)胞,其細(xì)胞形態(tài)明顯地由貼壁的梭形變?yōu)椴灰?guī)則的橢圓形,且形態(tài)變化趨向橢圓形與M~βCD的處理量和處理時(shí)間成正比。當(dāng)8mM的M~βCD處理細(xì)胞1h或者16mM的M~βCD處理細(xì)胞2h后,細(xì)胞膜邊緣模糊,細(xì)胞貼壁不牢,有凋亡傾向。 (2)用M~βCD處理1h后的U937和HEK293細(xì)胞膜表面熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),細(xì)胞群向高熒光區(qū)域分布更加彌散,且隨著M~βCD濃度的增加(0,8,16mM),其膜表面熒光強(qiáng)度值也相應(yīng)增加(HEK293:149,470,904;U937:177,892,2242)。U937細(xì)胞經(jīng)M~βCD處理后在此方面較HEK293細(xì)胞更為突出。表明M~βCD處理可以增加細(xì)胞膜流動(dòng)性。 (3)經(jīng)BBR(10～40μg/mL)處理過(guò)的U937和HEK293細(xì)胞群明顯向高熒光區(qū)域分布,且彌散程度增大(HEK293:BBR 0、5、10、20、40、60、80μg/mL,熒光強(qiáng)度值606、687、718、1045、1165、832、730;U937:BBR 0、5、10、20、30、40gg/mL,熒光強(qiáng)度值175、180、218、264、262、208)。隨著B(niǎo)BR濃度的增加,散點(diǎn)的分布區(qū)域逐漸擴(kuò)大,提示膜流動(dòng)性的增加。與M~βCD處理組對(duì)比,BBR處理組增加U937和HEK293胞膜流動(dòng)性不如直接降低膜膽固醇含量效果顯著。 結(jié)果表明:BBR處理細(xì)胞與M~βCD處理結(jié)果一致,二者均對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生膜流動(dòng)性增加的影響。 3.細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果: (1)4mM和8mM M~βCD分別處理U937 2h后對(duì)A549細(xì)胞的殺傷率相應(yīng)為11.2%和16.8%,可見(jiàn)隨著M~βCD濃度加大sTNF-α的分泌相應(yīng)增加。 (2)15μg/mL和30μg/mL BBR分別處理U937細(xì)胞后上清對(duì)A549的殺傷率為相應(yīng)為0.5%和0.7%:100ng/mL PMA處理組的殺傷率達(dá)到19.1%;100ng/mLPMA和30μg/mL BBR同時(shí)處理U937后,殺傷率下降為7.5%;高于40μg/mL時(shí),BBR促使A549凋亡。結(jié)果提示BBR不誘發(fā)sTNFα的分泌,同時(shí)可以抑制PMA對(duì)U937的刺激作用。 sTNF-α的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)可以間接評(píng)價(jià)其主要分泌酶TACE的活性。結(jié)果表明,BBR處理細(xì)胞并未表現(xiàn)出與M~βCD和PMA處理的一致性,原因可能與它抑制內(nèi)毒素的作用有關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)BBR的濃度大于40μg/mL,或者共孵育時(shí)間超過(guò)24h,則會(huì)促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。 4.底物肽-HPLC實(shí)驗(yàn)測(cè)TACE活性結(jié)果: (1)8mM和16mM的M~βCD處理HEK293細(xì)胞30min后,觀察活細(xì)胞膜上水解酶對(duì)TNF-α模擬肽Dnp-SPLAQAVRSSSR-NH_2的水解活性。發(fā)現(xiàn)經(jīng)M~βCD處理后TACE的特異性裂解肽峰峰面積比例明顯增加,且隨著M~βCD處理濃度(8～16mM)和酶解反應(yīng)時(shí)間(5～15min)的增加,裂解肽峰面積比例也相應(yīng)增加。 (2)10μg/mL和20μg/ mL BBR分別處理HEK293細(xì)胞6h和24h后,將細(xì)胞與底物肽共孵育,在反應(yīng)初期(5-15min)觀察到TACE特異性裂解肽峰峰面積比例較未處理前增加,且有濃度時(shí)間依賴關(guān)系。裂解峰峰面積的增加說(shuō)明酶促反應(yīng)產(chǎn)率的增加,提示TACE水解活性的增強(qiáng)。BBR處理細(xì)胞與M~βCD處理結(jié)果一致,表明二者都能增強(qiáng)膜酶TACE水解活性。 5.RT-PCR實(shí)驗(yàn)中,以看家基因β-actin為參照,處理組和對(duì)照組的TACE mRNA水平在12h和24h均沒(méi)有顯著性差異(p＜0.05)。結(jié)果表明,不支持BBR通過(guò)增強(qiáng)TACE基因轉(zhuǎn)錄或mRNA穩(wěn)定性來(lái)影響TACE活性的分子機(jī)制。 【結(jié)論】 本部分成功建立了基于FACS技術(shù)的細(xì)胞膜流動(dòng)性檢測(cè)方法。該方法對(duì)懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞均可適用。該方法與傳統(tǒng)的DPH標(biāo)記熒光偏振檢測(cè)技術(shù)相比較,具有準(zhǔn)確性更高,操作更簡(jiǎn)單,可重復(fù)定量分析等突出的優(yōu)點(diǎn),同時(shí)也是對(duì)FACS技術(shù)應(yīng)用的一個(gè)新的嘗試。本文利用該方法定性分析了細(xì)胞膜膽固醇降低所導(dǎo)致的質(zhì)膜流動(dòng)性的增加,與文獻(xiàn)報(bào)道一致。 安全無(wú)毒的傳統(tǒng)中藥黃連素小檗堿(BBR),已有研究證明具有降膽固醇含量的藥理作用,并因而可用于輔助治療高血脂癥;同時(shí)黃連素還具有顯著的抑制血管平滑肌增殖、抗血小板、抗炎、抗老年斑和抗腫瘤等作用,因而在心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面有廣泛應(yīng)用前景。本文試圖將黃連素的這些藥理活性與膜流動(dòng)性增加建立聯(lián)系,并通過(guò)觀察黃連素對(duì)TACE水解活性和mRNA表達(dá)水平的影響,初步探索黃連素對(duì)TACE活性影響的機(jī)制。 首先證實(shí)了物理性降低膜膽固醇可以帶來(lái)膜流動(dòng)性的增加,也可以增加細(xì)胞膜酶的水解活性;然后證實(shí)了BBR同樣有上述行為,同時(shí)并不增加TACEmRNA的表達(dá)水平。結(jié)果提示BBR增加TACE活性可能循于細(xì)胞膜流動(dòng)性增加而導(dǎo)致的脂筏上酶分子構(gòu)象變化而被激活的機(jī)制,而不支持BBR導(dǎo)致TACE在膜上的表達(dá)增加的分子機(jī)制。這為BBR的調(diào)脂和抗老年斑抗腫瘤活性提供了一種新的解釋和研究思路,從理論上支持了抗衰老的“加強(qiáng)α-分泌酶活性”的指導(dǎo)策略,也指出了一條用中藥進(jìn)行調(diào)節(jié)的新途徑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R341

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 黃京飛,Ｔｏｍ Ｌ．Ｂｌｕｎｄｅlｌ;蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)的保守性與其功能的關(guān)系[J];動(dòng)物學(xué)研究;1999年01期

2 田原僮,鐘毅,潘玉琢,趙麗娟;小檗堿抗腫瘤的分子機(jī)制研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊(cè));2005年09期

3 周吉銀;周世文;;小檗堿降糖調(diào)脂作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J];解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào);2007年03期

4 謝培鳳,周暉,高彥彬;小檗堿治療2型糖尿病40例療效觀察[J];中國(guó)臨床保健雜志;2005年05期

5 殷峻,陳名道,楊穎,唐金鳳,李鳳英;小檗堿對(duì)大鼠脂代謝的影響[J];上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2003年S1期

6 陳嵐,許彩民,袁建剛,潘華珍;脂筏的結(jié)構(gòu)與功能[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2003年01期

7 李力力,曹亞;脂筏——細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生的平臺(tái)[J];生命的化學(xué);2005年03期

8 王丙蓮;孟慶軍;張利群;楊俊慧;楊艷;;HPLC-MS/MS在活性多肽檢測(cè)中的應(yīng)用[J];食品研究與開(kāi)發(fā);2007年06期

9 張若蘅，徐筱杰，唐有祺;應(yīng)用反相高效液相色譜法分析純化化學(xué)合成肽[J];色譜;1996年03期

10 蘭進(jìn),楊世林,鄭玉權(quán),邵家斌,李勇;黃連的研究進(jìn)展[J];中草藥;2001年12期

，

本文編號(hào)：2003302