本文選題：ADAMTS-7 + ADAMTS-12��； 參考：《山東大學(xué)》2009年博士論文

【摘要】： 金屬蛋白酶ADAMTS-7和ADAMTS-12同屬于ADAMTS家族(含TSP結(jié)構(gòu)的去整合素金屬蛋白酶,a disintegrin and metalloprotease with thromospondinmotifs,ADAMTS),其對(duì)降解軟骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和關(guān)節(jié)炎具有非常重要的作用。ADAMTS家族含有分泌性鋅指蛋白,并且有較嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆肿咏Y(jié)構(gòu),至少包括一個(gè)thrombospondin motif重復(fù)結(jié)構(gòu)。這個(gè)家族具有重要的功能,ADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5、ADAMTS-8、ADAMTS-9、ADAMTS-16和ADAMTS-18可以降解多聚蛋白糖,ADAMTS-5在小鼠關(guān)節(jié)炎模型中蛋白多聚糖的丟失上起著重要的作用。ADAMTS-7和ADAMTS-12具有相同的結(jié)構(gòu)域組成,構(gòu)成ADAMTS家族的亞型。我們最初報(bào)道ADAMTS-7和ADAMTS-12直接結(jié)合并降解軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COMP),一種軟骨最主要的非膠原組成物。另外,我們研究發(fā)現(xiàn)α-2-巨球蛋白可以抑制COMP蛋白的降解。最近還有研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS-12也能夠降解軟骨聚集蛋白多糖。 本文的研究發(fā)現(xiàn),在軟骨分化過(guò)程中ADAMTS-7和ADAMTS-12的表達(dá)量都顯著增高,意味著在骨骼發(fā)育中ADAMTS-7和ADAMTS-12的表達(dá)量在時(shí)間、空間上都有變化。我們的研究重點(diǎn)關(guān)注ADAMTS-7和ADAMTS-12在軟骨分化中的作用,以及涉及到的分子機(jī)制。我們研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS-7和ADAMTS-12蛋白在軟骨分化中被誘導(dǎo)表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果揭示在體外軟骨分化的第5天,這兩種蛋白的表達(dá)量還較低,但從第7天開始,他們的量成三倍增長(zhǎng),并在分化后期一直維持此高表達(dá)狀態(tài)。本文中,我們首次發(fā)現(xiàn)ADAMTS-7和ADAMTS-12都能夠抑制軟骨細(xì)胞的分化及軟骨成骨。 我們研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS-7對(duì)軟骨細(xì)胞的分化及軟骨成骨的抑制功能是依賴于ADAMTS-7的蛋白酶活性的。ADAMTS-7的cysteine-rich結(jié)構(gòu)域?qū)τ贏DAMTS-7與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用和細(xì)胞膜表面定位是必不可少的,C-末端的4個(gè)thromospondin motif結(jié)構(gòu)域?qū)τ贏DAMTS-7的蛋白水解酶活性和抑制軟骨細(xì)胞分化功能也是必需的。因此,ADAMTS-7對(duì)于軟骨細(xì)胞分化和軟骨成骨,是一個(gè)潛在的負(fù)調(diào)控因子,這種抑制功能嚴(yán)格地依賴于ADAMTS-7的酶切活性。而當(dāng)ADAMTS-7發(fā)生點(diǎn)突變后,則完全喪失了酶切活性,同時(shí)也喪失了對(duì)軟骨細(xì)胞的抑制作用。ADAMTS-7由多個(gè)功能性亞基構(gòu)成,包括一個(gè)鋅離子催化結(jié)構(gòu)域和其他幾個(gè)非催化結(jié)構(gòu)域,包括:1個(gè)disintegrin結(jié)構(gòu)域、1個(gè)thrombospondin結(jié)構(gòu)域、1個(gè)cysteine-rich結(jié)構(gòu)域(CRD)、1個(gè)spacer-1結(jié)構(gòu)域、3個(gè)thrombospondin motifs、1個(gè)spacer-2結(jié)構(gòu)域和C-末端4個(gè)thrombospondin motifs。研究發(fā)現(xiàn)C-末端的4個(gè)thrombospondin motifs具有結(jié)合底物的功能,如結(jié)合COMP,而ADAMTS-7的其他功能結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)功能卻還都不清楚。為了揭示各個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能,我們構(gòu)建了一系列的ADAMTS-7的C-末端缺失突變體,發(fā)現(xiàn)ADAMTS-7的cysteine-rich結(jié)構(gòu)域?qū)τ贏DAMTS-7與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)相互作用和細(xì)胞膜表面定位是必不可少的。然而有趣的是,ADAMTS-7及一系列C-末端缺失突變體蛋白在Cos-7細(xì)胞中的檢測(cè)結(jié)果顯示,cysteine-rich結(jié)構(gòu)域?qū)DAMTS-7蛋白定位的影響,是有細(xì)胞類型特異性的。另外,ADAMTS-7的酶切活性同樣也受到非催化亞基的調(diào)控,尤其是C-末端的4個(gè)thrombospondinmotifs和抑制性spacer-2結(jié)構(gòu)域。 ADAMTS-7和ADAMTS-12是PTHrP重要的靶分子,原因如下:(1)PTHrP誘導(dǎo)ADAMTS-7和ADAMTS-12的表達(dá),(2)在PTHrP基因敲除小鼠的軟骨生長(zhǎng)板上幾乎檢測(cè)不到ADAMTS-7和ADAMTS-12的表達(dá),(3)沉默ADAMTS-7/ADAMTS-12或用特異性抗體封閉ADAMTS-7/ADAMTS-12的活性,則幾乎阻斷了PTHrP介導(dǎo)的抑制軟骨細(xì)胞肥大化和軟骨成骨的生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS-7和一個(gè)新的軟骨生長(zhǎng)因子GEP(Granulin-epithelin precursor)相互作用。骨骺生長(zhǎng)板內(nèi)的軟骨內(nèi)骨化過(guò)程,涉及多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑。我們的研究證明:1)過(guò)表達(dá)ADAMTS-7和ADAMTS-12誘導(dǎo)PTHrP,抑制IHH;2)在體外軟骨分化過(guò)程中,PTHrP促進(jìn)ADAMTS-7和ADAMTS-12的表達(dá):3)在小鼠生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞中,ADAMTS-7和ADAMTS-12的表達(dá)依賴于PTHrP信號(hào)途徑。這些研究結(jié)果揭示在軟骨分化過(guò)程中,ADAMTS-7、ADAMTS-12和PTHrP信號(hào)途徑之間存在一個(gè)正反饋通路。另外,ADAMTS-7、ADAMTS-12是PTHrP的下游靶分子,基于以下原因:1)PTHrP抑制軟骨分化過(guò)程中Col X的表達(dá),然而當(dāng)通過(guò)特異性干擾RNA抑制ADAMTS-7/ADAMTS-12或用抗ADAMTS-7/ADAMTS-12的抗體封閉后,PTHrP的抑制作用則消失了;再次表達(dá)ADAMTS-7/ADAMTS-12,則PTHrP的抑制作用又重新回復(fù):2)ADAMTS-7/ADAMTS-12抗體的封閉,則完全中和了PTHrP所抑制的軟骨細(xì)胞肥大化、礦化和骨生長(zhǎng)。另外,研究發(fā)現(xiàn)PTHrP促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖,ADAMTS-7發(fā)現(xiàn)也具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的功能,而且此促細(xì)胞增殖作用主要依賴于C-末端的4個(gè)thrombospondin motifs結(jié)構(gòu)域。 另外ADAMTS-7可以作為GEP-轉(zhuǎn)化酶,抵消GEP刺激誘導(dǎo)的軟骨分化及軟骨內(nèi)成骨�？傊�,我們的試驗(yàn)結(jié)果證明,ADAMTS-7是PTHrP信號(hào)途徑下游的非常重要的靶分子,負(fù)調(diào)控軟骨內(nèi)成骨過(guò)程;直接結(jié)合、轉(zhuǎn)化GEP,從而失活軟骨分化生長(zhǎng)因子GEP的誘導(dǎo)分化作用。GEP是一種生長(zhǎng)因子,參與組織重生、腫瘤形成和炎癥過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)GEP與彈性蛋白酶結(jié)合,被彈性蛋白酶降解。彈性蛋白酶消化GEP的顆粒內(nèi)連接子,產(chǎn)生微粒多肽;然而分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制因子(secretory leukocyte protease inhibitor,SLPI)直接結(jié)合到彈性蛋白酶或抑制顆粒多肽與蛋白酶的結(jié)合,繼而封閉彈性蛋白酶的活性。最近研究揭示蛋白酶3也結(jié)合并降解GEP;蛋白酶3和彈性蛋白酶都通過(guò)降解抗炎癥作用的GEP,從而達(dá)到促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞依賴性的致炎癥功能。本文中,我們提供了足夠的試驗(yàn)證據(jù)表明GEP和金屬蛋白酶ADAMTS-7在軟骨細(xì)胞內(nèi)相互作用,ADAMTS-7可以將GEP轉(zhuǎn)化為小分子片段;另外,GEP能具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化和軟骨成骨,而ADAMTS-7很可能是通過(guò)失活GEP的活性而抑制軟骨分化及軟骨成骨的。我們以往研究發(fā)現(xiàn):1)ADAMTS-7結(jié)合并降解COMP,2)COMP和GEP相互作用,促進(jìn)GEP刺激的軟骨分化功能。結(jié)合現(xiàn)在我們的結(jié)果ADAMTS-7和GEP相互作用,我們發(fā)現(xiàn)ADAMTS-7、GEP和COMP形成一個(gè)調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞功能的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)。然而ADAMTS-7、生長(zhǎng)因子GEP和細(xì)胞外基質(zhì)COMP之間是如何相互作用,如何調(diào)控軟骨細(xì)胞分化和軟骨成骨的。 本文研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS-7和ADAMTS-12是PTHrP調(diào)控通路中的新調(diào)控因子,同時(shí)也可調(diào)控軟骨細(xì)胞分化和軟骨內(nèi)成骨。本文對(duì)ADAMTS-7、ADAMTS-12負(fù)調(diào)節(jié)軟骨分化的機(jī)制進(jìn)行了初步探討,例如金屬蛋白酶ADAMTS-7和促軟骨分化作用的生長(zhǎng)因子GEP相結(jié)合,通過(guò)轉(zhuǎn)化GEP成片段從而抑制GEP刺激的軟骨分化作用。另外,本文也為軟骨關(guān)節(jié)炎疾病提供了潛在的靶分子。
[Abstract]:An important role in the degradation of extracellular matrix proteins and arthritis in mouse arthritis models has been reported . It is also found that the 偽 - 2 - macroglobulin can inhibit the degradation of the COMP protein . In addition , we have found that the 偽 - 2 - macroglobulin can inhibit the degradation of the COMP protein .



In this paper , we found that in the course of the differentiation of cartilage , the expression of TS - 7 and TS - 12 was significantly increased , which means that the expression level of TS - 7 and TS - 12 in cartilage was changed in time and space .



In order to reveal the function of these domains , it has been found that the cysteine - rich domain of the C - terminal is essential for the interaction between the extracellular matrix and the surface of the cell membrane .



PTHrP is an important target molecule for PTHrP . It is shown as follows : ( 1 ) PTHrP induces the expression of TS - 7 and TS - 12 , and ( 3 ) the inhibitory effect of PTHrP on chondrogenic differentiation is dependent on PTHrP signaling pathway .



In conclusion , we have provided sufficient experimental evidence to bind to elastase or inhibit the differentiation of cartilage into bone . In addition , it has been found that GEP is binding to elastase or inhibits the differentiation of cartilage into bone .



In this paper , it is found that the new regulation factors in the PTHrP regulatory pathway can regulate the differentiation of cartilage cells and the formation of bone in cartilage . In this paper , the mechanism of chondrogenic differentiation is discussed in this paper . For example , the mechanism of the chondrodifferentiation is combined with the growth factor GEP , which can inhibit the differentiation of GEP by transforming GEP . In addition , the present paper also provides the potential target molecule for the disease of cartilage .
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R341

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1983385