發(fā)布時間：2018-06-05 20:30

  本文選題：Kazrin + ARC��； 參考：《天津醫(yī)科大學》2009年博士論文

【摘要】：目的： 新近發(fā)現(xiàn)的Kazrin蛋白是在進化中非常保守的蛋白,能與橋粒、ARC等蛋白相互作用。我們發(fā)現(xiàn)了Kazrin的一種新的異構體,在人的腦膠質(zhì)瘤細胞(U373MG細胞)株中表達,但它的確切的功能還不清楚,本研究擬運用RNAi技術,探討Kazrin蛋白的功能,以及發(fā)揮這種功能的機制。 方法： 根據(jù)本實驗室前期工作中鑒定的新的Kazrin的序列設計Kazrin siRNA,將Kazrin siRNA的cDNA插入載體pSilencer2.1,構建pSilencer/Kazrin-siRNA質(zhì)粒,將不同劑量的pSilencer/Kazrin-siRNA轉(zhuǎn)染U373MGMG細胞,24h后MTT法檢測細胞活性,TUNEL法檢測細胞凋亡,比色法檢測caspase-3活性的變化。構建Kazrin siRNA作用位點突變但氨基酸序列不變的pcDN A3/Flag-Kazrin-m,轉(zhuǎn)染U373MG細胞,篩選表達Kazrin-m的單克隆細胞株,再用pSilencer/Kazrin-siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Kazrin-m表達陽性的U373MG細胞,24h后MTT法檢測細胞活性。構建cDNA3/Flag-ARC、pcDNA3/Flag-Bax質(zhì)粒,用免疫共沉淀和免疫熒光共定位的方法,證實Kazrin與ARC、Bax相互作用。 結果： 1、pSilencer/Kazrin-siRNA能有效地抑制U373MG細胞中內(nèi)源性Kazrin的表達,但不能抑制Kazrin siRNA作用位點突變但氨基酸序列不變的pcDNA3/Flag-Kazrin-m的表達。 2、RNAi技術靜默Kazrin蛋白的表達后,U373MG細胞的細胞活性和細胞的凋亡與Kazrin siRNA的表達水平有關,caspase-3的活性增強。 3、pcDNA3/Flag-Kazrin-m能拯救pSilencer/Kazrin-siRNA引起的U373MGMG細胞的凋亡。 4、免疫共沉淀和免疫熒光共定位證實Kazrin與ARC、Bax互作用,Kazrin可能通過這兩種蛋白而參與凋亡。 結論： 1、在細胞凋亡的研究領域,我們用RNAi技術和MTT、TUNEL檢測方法,首次證實了一種新的蛋白——Kazrin蛋白與細胞凋亡有關,是一種新的抗凋亡蛋白。 2、通過免疫共沉淀和免疫熒光共定位證實Kazrin與凋亡途徑中兩種重要的蛋白ARC、BAX相互作用,提示Kazrin可能通過這兩種蛋白參與細胞凋亡。
[Abstract]:Aim: the recently discovered Kazrin protein is a very conserved protein in evolution and can interact with desmosome ARC and other proteins. We found a new isoform of Kazrin, which was expressed in human glioma cell line U373MG, but its exact function is not clear. In this study, we intend to use RNAi technique to explore the function of Kazrin protein. Methods: Kazrin siRNAs were designed according to the sequence of Kazrin which was identified in previous work in our laboratory. The cDNA of Kazrin siRNA was inserted into the vector pSilencer2.1 to construct pSilencerr Kazrin-siRNA plasmid. After different doses of pSilencer / Kazrin-siRNA were transfected into U373MGMG cells for 24 hours, the apoptosis of U373MGMG cells was detected by MTT assay and the change of caspase-3 activity by colorimetric assay. Kazrin siRNA interaction site mutation but amino acid sequence invariant pcDN A 3 / Flag-Kazrin-m. transfected U373MG cell line, screened the Kazrin-m expression monoclonal cell line, then transfected Kazrin-siRNA plasmid into Kazrin-m positive U373MG cell line for 24 hours. The construction of pcDNA3 / Flag-Bax plasmid of cDNA3 / Flag-ARCX was used to confirm the interaction between Kazrin and ARCN Bax by immunoprecipitation and immunofluorescence co-localization. Results: 1pSilencer / Kazrin-siRNA could effectively inhibit the expression of endogenous Kazrin in U373MG cells. But it could not inhibit the expression of pcDNA3 / Flag-Kazrin-m with mutation of Kazrin siRNA action site but invariant amino acid sequence. 2The cell activity and apoptosis of U373MG cells were silent after Kazrin protein expression. 3pcDNA3 / Flag-Kazrin-m could increase the activity of Kazrin siRNA. 3 pcDNA3 / Flag-Kazrin-m could not inhibit the expression of Kazrin siRNA. 3pcDNA3 / Flag-Kazrin-m could increase the activity of ppcDNA3 / Flag-Kazrin-m. Rescue pSilencerr / Kazrin-siRNA induced apoptosis in U373MGMG cells. 4. Co-immunoprecipitation and immunofluorescence co-localization confirmed that Kazrin may be involved in apoptosis through these two proteins. Conclusion: 1, in the field of apoptosis, Kazrin may be involved in apoptosis. We demonstrated for the first time that a new protein, Kazrin protein, was associated with apoptosis by RNAi and MTTT-Tunel assay. Kazrin is a new antiapoptotic protein. It is proved that Kazrin interacts with two important proteins in apoptosis pathway by immunoprecipitation and immunofluorescence co-localization, suggesting that Kazrin may participate in apoptosis through these two proteins.
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R363

【共引文獻】

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本文編號：1983310