本文選題：褪黑素 + 油酸��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 目的:急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是臨床常見的由感染等多種因素引起的彌漫性肺實(shí)質(zhì)損傷,也是全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)或多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)在肺部的典型表現(xiàn)。ALI的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜,迄今為止尚未完全闡明。以往研究證明機(jī)體尤其是肺部的氧化/抗氧化平衡失調(diào)在ALI的發(fā)病中起主要作用,因?yàn)楫?dāng)肺臟受到各種致病因素(如創(chuàng)傷、休克、感染等)的作用時,可導(dǎo)致肺臟局部產(chǎn)生劇烈的氧化應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)而引起ALI。近來研究顯示肺組織內(nèi)中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophil, PMN)浸潤是ALI發(fā)病過程中的早發(fā)事件,PMN在肺內(nèi)的“扣押”是引發(fā)損傷的關(guān)鍵。PMN在肺內(nèi)和/或循環(huán)血液中各種炎性刺激(如LPS、TNF、IL-I等)的作用下,首先扣押于肺微血管內(nèi),繼而粘附于內(nèi)皮細(xì)胞并被激活,然后游出肺血管床并持續(xù)活化,釋放一系列損傷介質(zhì),引起肺泡彌漫性損害。P-選擇素通常儲存于內(nèi)皮細(xì)胞的分泌顆粒中,經(jīng)刺激后數(shù)分鐘內(nèi)即動員到內(nèi)皮細(xì)胞表面,主要參與介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的起始粘附。近年研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)是介導(dǎo)PMN參與肺損傷的分子生物學(xué)基礎(chǔ);另有研究顯示,ICAM-1可作為肺血管內(nèi)皮細(xì)胞活化的標(biāo)志物。因此中性粒細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞等釋放大量促炎因子、炎性介質(zhì)進(jìn)而引起嚴(yán)重反應(yīng)的級聯(lián)放大作用,在ALI的發(fā)病過程中起著重要作用。如能有效控制炎癥反應(yīng)維持肺臟氧化/抗氧化的平衡,對于ALI的治療具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是近年來引人注目的蛋白激酶級聯(lián)通路,其中p38MAPK通路與炎癥反應(yīng)的調(diào)控密切相關(guān)。 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)是生物體內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一,是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,由細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、c-jun氨基未端激酶(c-Jun-NH2-terminal kinase, JNK)、p38和ERK5四條級聯(lián)反應(yīng)途徑組成。每個MAPK都有自己不同的上游激酶和特異性底物,代表了對不同刺激引起細(xì)胞生理反應(yīng)的一種普遍機(jī)制。從細(xì)胞外刺激作用于細(xì)胞到出現(xiàn)相應(yīng)的生物學(xué)反應(yīng),需要通過包括MAPK、MAPKK和MAPKKK 3個關(guān)鍵激酶的級聯(lián)反應(yīng),按照Ras-Raf(MAPKKK)-MAPKK-MAPK的順序依次激活下游激酶,最后轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核,激活轉(zhuǎn)錄因子Elk、ATF2和AP-1等,啟動相關(guān)細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的基因表達(dá)。這種由多個激酶調(diào)節(jié)的級聯(lián)反應(yīng),不僅使信號“瀑布”式放大,而且還通過各個激酶間的相互作用對信號進(jìn)行整合,從而保證了信號的精確性和特異性。 實(shí)驗(yàn)表明,p38MAPK通路對機(jī)體有保護(hù)性作用。但由于TNF-α、IL-1等持續(xù)高水平而導(dǎo)致的炎性過程可能與p38MAPK的過度激活有關(guān),尤其在LPS誘導(dǎo)的多種細(xì)胞因子合成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到關(guān)鍵性作用。Beaty等實(shí)驗(yàn)表明p38MAPK途徑介導(dǎo)了LPS作用的中性粒細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),p38MAPK在LPS作用下被磷酸化,活化的p38MAPK即由胞漿進(jìn)入胞核,轉(zhuǎn)錄生成大量的炎性因子。有研究已證明抑制p38MAPK途徑,能夠有效的抑制炎癥反應(yīng)。褪黑素是已發(fā)現(xiàn)的具有強(qiáng)抗氧化應(yīng)激作用的激素,并在抗炎方面有積極作用,但其作用與p38MAPK途徑是否相關(guān),國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報道甚少,其機(jī)制尚待研究。 褪黑素最早認(rèn)為對機(jī)體的生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、精神神經(jīng)系統(tǒng)和生物節(jié)律等都有明顯的調(diào)節(jié)作用,同時與睡眠、鎮(zhèn)靜等生物學(xué)行為有關(guān)。20世紀(jì)90年代初,Tan等首次報道MT具有抗氧化活性,是一種高效的內(nèi)源性自由基清除劑,這將進(jìn)一步擴(kuò)大褪黑素在急性肺損傷方面的應(yīng)用,故MT抗ALI機(jī)制仍然是目前的研究熱點(diǎn)。但是,MT抗氧化抗炎作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑目前仍不十分清楚,因此從分子水平研究上述問題,為MT的廣泛應(yīng)用開辟更為廣闊的前景。本實(shí)驗(yàn)通過靜脈注射油酸復(fù)制急性肺損傷動物模型,旨在探討ALI和p38MAPK信號通路活化的關(guān)系及MT抗ALI的可能機(jī)制,為MT的臨床應(yīng)用提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:本實(shí)驗(yàn)采用尾靜脈注射油酸(OA)復(fù)制大鼠急性肺損傷(ALI)模型,并通過腹腔給予褪黑素(MT)及應(yīng)用p38MAPK特異性抑制劑SB203580,觀察不同時間點(diǎn)肺組織病理學(xué)改變并采用免疫組化技術(shù)觀察肺組織中P-選擇素(Ps)、細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的表達(dá)變化。 將84只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,隨機(jī)分為7組,每組12只。 (1)Control組:經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水(NS),每只0.2 ml/kg; (2)OA組:經(jīng)尾靜脈注射油酸(OA),每只0.2 ml/kg; (3)MT+OA組:經(jīng)尾靜脈注射油酸,每只0.2 ml/kg,并在注射前30分鐘腹腔注射褪黑素(MT)20 mg/kg; (4)OA+SB203580(p38MAPK特異性抑制劑)組:經(jīng)尾靜脈注射油酸(OA),每只0.2 ml/kg,并在注射前30分鐘尾靜脈注射SB203580(5μmol/L),每只0.2 ml/kg; (5)MT+OA+SB203580組:經(jīng)尾靜脈注射油酸(OA),每只0.2 ml/kg,并在注射前30分鐘經(jīng)腹腔注射褪黑素(MT)20 mg/kg和尾靜脈注射SB203580(5μmol/L),每只0.2 ml/kg; (6)MT組:經(jīng)腹腔注射褪黑素(MT)20 mg/kg; (7)SB203580組:經(jīng)尾靜脈注射SB203580(5μmol/L)0.2 ml/kg。各組動物分別于注射油酸后觀察大鼠行為學(xué)改變,并在1 h、3 h和6 h開胸經(jīng)左心室取血后處死,同時留取肺部標(biāo)本。肺部標(biāo)本觀察肺系數(shù)及形態(tài)學(xué)變化,同時采用免疫組織化學(xué)染色和圖像分析觀察肺組織中P-選擇素(Ps)、細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的表達(dá)和分布。 數(shù)據(jù)處理利用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)來表示,組間差異用單因素方差分析(One Way ANOVA),有顯著差異者用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較,均以P0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果: 1大鼠行為學(xué)改變OA組大鼠出現(xiàn)呼吸急促、精神萎靡、蜷縮成團(tuán)、毛發(fā)豎起,未見攝食。 2肺組織形態(tài)學(xué)改變Control組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰,肺泡壁薄,肺泡腔內(nèi)無滲出液;OA組肺組織損傷嚴(yán)重,肺泡間隔明顯增寬,肺泡腔及肺組織間質(zhì)彌漫性炎細(xì)胞浸潤;應(yīng)用MT和/或OA+SB203580肺組織損傷較OA組有所減輕;單純應(yīng)用MT組或SB203580大鼠肺組織結(jié)構(gòu)未見異常變化。 3肺系數(shù)(肺質(zhì)量g/體重Kg)各時間點(diǎn)OA組大鼠肺系數(shù)明顯升高,與Control組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);應(yīng)用MT和/或SB203580后,肺系數(shù)有所下降(P0.05),但仍高于Control組,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);單純應(yīng)用MT或SB203580與Control組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 4肺組織免疫組織化學(xué)染色 ①Ps:Control組Ps肺臟表達(dá)的陽性信號(棕黃色)分布于氣道黏膜上皮細(xì)胞,為胞漿陽性,且陽性信號較弱,血管內(nèi)皮細(xì)胞未見表達(dá);OA組各時間點(diǎn)的陽性信號較Control組明顯增強(qiáng)(P0.05),主要分布在氣道黏膜上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞,均為胞漿陽性;MT+OA組、OA+SB203580組、MT+OA+SB203580組的陽性細(xì)胞分布與OA組類似,但陽性信號明顯減弱(P0.05),尤其是血管內(nèi)皮細(xì)胞。 ②ICAM-1:Control組肺臟ICAM-1表達(dá)的陽性信號(棕黃色)分布于氣道黏膜上皮細(xì)胞,為胞漿陽性,且陽性信號較弱,血管內(nèi)皮細(xì)胞未見表達(dá);OA組各時間點(diǎn)的陽性信號較Control組明顯增強(qiáng)(P0.05),主要分布在氣道黏膜上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞,均為胞漿陽性;MT+OA組、OA+SB203580組、MT+OA+SB203580組的陽性細(xì)胞分布與OA組類似,但陽性信號明顯減弱(P0.05),尤其是血管內(nèi)皮細(xì)胞。 結(jié)論: 1 OA可引起大鼠肺組織嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),說明成功地復(fù)制了ALI動物模型。 2應(yīng)用p38MAPK抑制劑SB203580可抑制P-選擇素(Ps)和細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)在肺組織內(nèi)的表達(dá),提示p38MAPK信號通路在OA誘導(dǎo)的ALI中發(fā)揮重要作用。 3 MT對ALI時的肺臟起明顯的保護(hù)作用,其保護(hù)機(jī)制可能與MT的抗氧化作用和抑制p38MAPK信號通路的過度激活有關(guān)。
[Abstract]:Objective : Acute lung injury ( ALI ) is the most common cause of diffuse lung injury caused by multiple factors such as infection .



mitogen - activated protein kinase ( MAPK ) is an attractive protein kinase cascade pathway in recent years , in which p38MAPK pathway is closely related to the regulation of inflammatory response .



涓濊鍘熸椿鍖栬泲鐧芥縺閰，

本文編號：1946507