本文選題：BDE-209 + 神經(jīng)干細(xì)胞　； 參考：《廣州醫(yī)學(xué)院》2010年碩士論文

【摘要】：【背景】 1.關(guān)于PBDEs(多溴聯(lián)苯醚) 多溴聯(lián)苯醚(Polybrominated Diphenyl Ethers,PBDEs)是溴代類化合物,常作為阻燃劑加到油漆,塑料,紡織,電子電器等人造產(chǎn)品中,目前已廣泛應(yīng)用于電子、電腦和泡沫等家具中。自20世紀(jì)70年代生產(chǎn)和使用多溴聯(lián)苯醚至今,已造成多溴聯(lián)苯醚的全球性環(huán)境污染。有資料顯示,發(fā)達(dá)國家80 %的電子垃圾進(jìn)入中國、印度和巴基斯坦等國,其中中國又占了90 %,導(dǎo)致城市的戶外空氣中PBDEs濃度比農(nóng)村空氣中的10倍還多,在我國一些地區(qū)已形成了電子垃圾拆解集散地,原始的拆解手段(露天焚燒、烘烤和酸洗等)使PBDEs等持久性有毒污染物不斷向周圍釋放,嚴(yán)重污染了當(dāng)?shù)丨h(huán)境,危害人體健康. 由于PBDEs具有難降解性、環(huán)境穩(wěn)定性、高脂溶性和生物放大作用,能夠通過食物鏈的轉(zhuǎn)移,使生物受到毒害,最終導(dǎo)致對人體健康的危害。研究表明,20世紀(jì)80年代初以來,環(huán)境中和人母乳中多溴聯(lián)苯醚不斷以指數(shù)形式增加,這與全球PBDEs需求的增長是一致的。PBDEs在環(huán)境中能穩(wěn)定存在,并可沿著食物鏈傳播,最終通過食物、母乳、大氣和室塵等蓄積在人體內(nèi).目前研究認(rèn)為,PBDEs(主要是低溴類)進(jìn)入機體后多數(shù)積累在脂肪組織,對機體健康產(chǎn)生不良影響。PBDEs在鼠類脂肪組織中的半衰期為19-119天,含溴越多的PBDEs同系物,半衰期越長。多溴聯(lián)苯醚對試驗動物有致癌性、生殖毒性、神經(jīng)毒性和內(nèi)分泌干擾毒性,因此,在美國及歐洲等地,相繼限制生產(chǎn)和使用低溴類如BDE-47,99,153等,但高溴類如BDE-209因其阻燃性好,其生物毒性不確定而仍在廣泛使用。人們對PBDEs毒性的了解遠(yuǎn)不如PCBs。目前,實驗室研究證據(jù)積累相對較多,而人群研究對象主要是職業(yè)人群,數(shù)據(jù)相對缺乏。不同職業(yè)的人群中PBDEs同系物的分布不完全相同。對荷蘭,美國,瑞士及中國人群調(diào)查發(fā)現(xiàn),多溴聯(lián)苯醚產(chǎn)品中,非職業(yè)暴露人群體內(nèi)主要BDE-153,職業(yè)暴露人群體內(nèi)主要BDE-209和BDE-183。 2.關(guān)于BDE-209(十溴聯(lián)苯醚) 十溴聯(lián)苯醚(Brominated Diphenyl Ethers-209 ,BDE-209)是一種含有十個溴原子的多溴聯(lián)苯醚,具有穩(wěn)定性好,添加量少,價格便宜等優(yōu)勢,據(jù)統(tǒng)計2001年十溴聯(lián)苯醚在所有PBDEs中使用占83.3%,其次就是BDE-206, BDE-208, BDE-207, BDE-203, BDE-47, BDE-153,2004年在中國十溴聯(lián)苯醚使用量達(dá)到25000噸,從2000年至2005年國內(nèi)使用含有十溴聯(lián)苯醚的材料增加了200%,從1萬噸至約3萬噸。因生物蓄積作用,BDE-209在血液中的濃度還將繼續(xù)升高。已經(jīng)在各種環(huán)境介質(zhì)(如大氣、沉積物、土壤、室內(nèi)空氣以及各種生物體等)和人體中檢測出,并且含量逐年增加。十溴聯(lián)苯醚排放到環(huán)境中后,經(jīng)光解、高溫分解、生物及微生物降解等過程,會轉(zhuǎn)化為多溴二苯并二惡英、多溴二苯并呋喃以及低溴代的聯(lián)苯醚,更容易進(jìn)入生物體,引起更強的毒性作用。試驗也證明BDE-209具有神經(jīng)發(fā)育毒性,免疫毒性,內(nèi)分泌毒性以及致癌性等。有研究者認(rèn)為高溴類PBDE在圍產(chǎn)期暴露可以導(dǎo)致仔鼠成年后的神經(jīng)自發(fā)行為以及學(xué)習(xí)記憶能力的影響。我們在前期實驗中也證實一定劑量的母源性BDE-209暴露可損傷子鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育,導(dǎo)致其神經(jīng)行為的改變;BDE-209的神經(jīng)發(fā)育毒性與其仔鼠神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷及細(xì)胞凋亡升高有關(guān),一定劑量BDE-209導(dǎo)致體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能改變。也有很多學(xué)者認(rèn)為BDE-209在體內(nèi)代謝快,蓄積低,在常規(guī)暴露水平對機體不造成影響,并且認(rèn)為BDE-209是阻止了大量火災(zāi)發(fā)生的功臣,由于目前國際上對BDE-209致生物健康的影響存在爭論,所以仍然有必要進(jìn)一步開展BDE-209對生物健康影響的研究。 3.關(guān)于神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs) 新記憶的形成,舊記憶的回想,學(xué)習(xí)能力的建立都與腦部海馬(hippocampus)部位有關(guān)。近年來,神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn),為學(xué)習(xí)記憶機制的研究提供了一個新的視點。有報道神經(jīng)干細(xì)胞分裂增殖越多,動物的學(xué)習(xí)記憶能力越強。神經(jīng)干細(xì)胞分裂增殖可能對學(xué)習(xí)記憶起調(diào)控的作用。在哺乳動物胚胎期,神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell,NSCs)主要分布在海馬、大惱皮質(zhì)、紋狀體、室管膜下層和中腦等區(qū)域。成年后在側(cè)腦室下區(qū)(subventficalar zone。SVZ)、海馬齒狀回(dentategyrus,DG)的顆粒細(xì)胞下區(qū)、紋狀體、脊髓等處也發(fā)現(xiàn)存在NSCs。神經(jīng)干細(xì)胞是一類具有分裂潛能和自我更新能力的母細(xì)胞,它可以通過不對等的分裂方式產(chǎn)生神經(jīng)組織的各類細(xì)胞.現(xiàn)發(fā)現(xiàn)NSC的生物學(xué)特征為:(1)具有自我更新能力;(2)具有多向分化潛能,可分化為神經(jīng)元、星形細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞;(3)處于高度未分化狀態(tài);(4)終生具有增殖分化能力,在有損傷的局部環(huán)境信號變化的刺激下可以增殖分化。其中(1)和(2)是NSC的兩個基本特征。NSC的增殖和分化調(diào)控是目前NSC研究的核心問題,最近的研究資料顯示,NSC的增殖、分化、遷移調(diào)控受多種相關(guān)因素的影響。大致分為:①內(nèi)源性因素:指可以對外界信號發(fā)生反碰并通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)自身NSCs的因素.包括一些NSCs內(nèi)的蛋白成分、各種因子(如EGF、FGF、IGF等)、離子、激素以及神經(jīng)介質(zhì),都是NSCs賴以存在和分化的必要因素,另外,一些轉(zhuǎn)錄因子和基因的激活與沉默也可影響NSCs的分化方向。②外源性因素:包括葡萄糖、氨基酸、維生素等是維持細(xì)胞存活的基本元素.細(xì)胞間各種因素的協(xié)調(diào)平衡、滲透壓、pH值、氧濃度和溫度等都對NSCs的增殖、遷移以及分化產(chǎn)生重要影響.另外.某些病理狀態(tài)如腦缺血也是NSCs的激活因素。本課題從細(xì)胞水平,選取不同濃度的十溴聯(lián)苯醚作為目標(biāo)化合物,體外傳代培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞,用不同濃度的BDE-209對新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行染毒,觀察神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài),檢測NSCs的增殖分化及凋亡狀況,以此來研究BDE-209對神經(jīng)干細(xì)胞的影響,探討神經(jīng)發(fā)育與環(huán)境因素的關(guān)聯(lián),初步探討B(tài)DE-209神經(jīng)毒性作用機制,本課題分為以下四個部分進(jìn)行各項具體實驗。 第一部分 BDE-209對體外培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)的影響 【目的】取新生1天SD大鼠的海馬組織進(jìn)行無血清傳代培養(yǎng),鑒別神經(jīng)干細(xì)胞的純度,染毒后測量形成神經(jīng)球數(shù)量及神經(jīng)球直徑,觀察BDE-209對體外培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)的影響。 【材料與方法】 1.購買新生1天SD大鼠,取大鼠海馬組織進(jìn)行體外神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)。 2.培養(yǎng)3-4代后海馬神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞鑒定及純度鑒別。 3.傳代培養(yǎng)3-4代的新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液后,暴露于BDE-209,實驗共分5組,空白對照組,DMSO對照組,實驗A組:BDE-209濃度為10ug/ml,實驗B組:BDE-209濃度為30ug/ml,實驗C組:BDE-209濃度為50ug/ml。每組設(shè)3個平行樣。DMSO對照組加入含1‰DMSO的培養(yǎng)液。 4.染毒72h后,在倒置顯微鏡下進(jìn)行神經(jīng)球形態(tài)觀察,利用美國Image-Pro-Plus 6.0圖象分析軟件記數(shù)形成神經(jīng)球的數(shù)目,測量神經(jīng)球的平均直徑。 【結(jié)果】 1.神經(jīng)干細(xì)胞鑒定結(jié)果:海馬組織培養(yǎng)經(jīng)3-5天可見神經(jīng)球形成,6-7后見神經(jīng)球逐漸增大,經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色證實新形成的神經(jīng)球呈現(xiàn)Nestin免疫染色陽性,提示所分離培養(yǎng)的細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞。 2.海馬神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)3-4代后在倒置顯微鏡下觀察,由數(shù)十到數(shù)百個細(xì)胞聚集形成大小不等的神經(jīng)球,折光性強,周圍光暈明顯,吹打成單細(xì)胞懸液后行免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定神經(jīng)干細(xì)胞的純度。由結(jié)果可見分散的神經(jīng)干細(xì)胞是主體,可占90%以上。 3.利用美國Image-Pro-Plus6.0圖象分析軟件記數(shù)形成神經(jīng)球的數(shù)目,測量神經(jīng)球的平均直徑可見:實驗組可見神經(jīng)球數(shù)目明顯減少,且神經(jīng)球平均直徑明顯減小,隨著BDE-209濃度加大,神經(jīng)球數(shù)目減少,平均直徑減小。 【結(jié)論】 以上提示:所分離培養(yǎng)的細(xì)胞形成懸浮生長的神經(jīng)球,經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定是神經(jīng)干細(xì)胞。BDE-209可以導(dǎo)致新生鼠海馬細(xì)胞形成神經(jīng)球數(shù)目及直徑改變,隨BDE-209濃度增加形成神經(jīng)球數(shù)目及直徑有不同程度的下降。 第二部分 BDE-209對體外培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響 【目的】 檢測BDE-209對體外培養(yǎng)新生鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響 【材料與方法】 1.傳代培養(yǎng)3-4代的新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞暴露于BDE-209，實驗共分5組，空白對照組，DMSO對照組，實驗A組：BDE-209濃度為10ug/ml,實驗B組：BDE-209濃度為30ug/ml,實驗C組：BDE-209濃度為50ug/ml。每組設(shè)3個平行樣。DMSO對照組加入含1‰DMSO的培養(yǎng)液。 2.經(jīng)MTT細(xì)胞增殖檢測法，分別于24，48，72，，96，120小時測定吸光度值 3.繪制細(xì)胞生長曲線.對A值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析. 【結(jié)果】 MTT結(jié)果顯示細(xì)胞生長總趨勢上升,隨著BDE-209作用劑量的增加，增殖能力下降，經(jīng)相關(guān)分析可見海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力與一定程度的BDE-209暴露劑量成負(fù)相關(guān)。 【結(jié)論】 無血清培養(yǎng)基分離培養(yǎng)的新生鼠海馬組織神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新和增殖能力，BDE-209可以導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力發(fā)生改變，隨BDE-209濃度增加神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力有不同程度的下降,這可能是BDE-209神經(jīng)毒性的作用機制之一。 第三部分 BDE-209對體外培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞分化的研究 【目的】探討十溴聯(lián)苯醚(BDE-209)對體外培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響 【材料與方法】 1.傳代培養(yǎng)3-4代的新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞，在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并暴露于BDE-209，實驗共分5組，空白對照組，DMSO對照組，實驗A組：BDE-209濃度為10ug/ml,實驗B組：BDE-209濃度為30ug/ml,實驗C組：BDE-209濃度為50ug/ml。每組設(shè)3個平行樣。DMSO對照組加入含1‰DMSO的培養(yǎng)液。隔天半量換液。 2.7天后進(jìn)行免疫熒光檢測，并運用美國Image-Pro-Plus6.0圖象分析軟件記數(shù)NF陽性,GFAP陽性,DAPI陽性細(xì)胞數(shù)目,計算NF+/DAPI+,GFAP+/ DAPI+比例,并測量NF+細(xì)胞突起長度。 【結(jié)果】 NF+細(xì)胞比例及NF+細(xì)胞突起長度隨著BDE-209濃度的增加而減少,GFAP+細(xì)胞比例隨著BDE-209濃度的增加而增加,存在劑量依賴關(guān)系. 【結(jié)論】 BDE-209可以導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元的比例發(fā)生改變,隨BDE-209濃度增加神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元的比例有不同程度的下降,分化成神經(jīng)元的突起長度也有不同程度的下降。 第四部分 BDE-209對體外培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的研究 【目的】 觀察BDE-209對海馬神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的影響。 【材料與方法】 1.傳代培養(yǎng)3-4代的新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞暴露于BDE-209,實驗共分5組,空白對照組,DMSO對照組,實驗A組:BDE-209濃度為10ug/ml,實驗B組:BDE-209濃度為30ug/ml,實驗C組:BDE-209濃度為50ug/ml。每組設(shè)3個平行樣。DMSO對照組加入含1‰DMSO的培養(yǎng)液。24h后進(jìn)行檢測。 2.采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測神經(jīng)干細(xì)胞凋亡。 【結(jié)果】 不同濃度的BDE-209作用24 h后,均可致神經(jīng)干細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。實驗A,B,C組作用24 h后其凋亡率均有明顯增高,表明BDE-209可導(dǎo)致海馬神經(jīng)干細(xì)胞凋亡,與對照組相比差異均有顯著意義(P 0.01)。 【結(jié)論】 BDE-209在一定劑量和作用時間內(nèi)可致海馬神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡。推測BDE-209在一定濃度范圍內(nèi)可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡,這可能是導(dǎo)致仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降的作用機制之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1945598