本文選題：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 + 膽堿能樣神經(jīng)元��； 參考：《山西醫(yī)科大學(xué)》2008年碩士論文

【摘要】： 第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定及其向膽堿能樣神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化 目的:從大鼠骨髓中分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)并探討其生物學(xué)特性。研究體外BMSCs向膽堿能樣神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的情況。 方法:采用全骨髓培養(yǎng)法體外分離培養(yǎng)獲得大鼠BMSCs,根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的貼壁能力進行純化,相差顯微鏡下觀察其形態(tài)變化,傳至三代的細(xì)胞一部分進行CD71免疫熒光技術(shù)檢測。另一部分細(xì)胞分為三組:誘導(dǎo)分化組,應(yīng)用音猬因子(sonic hedgehog,Shh)、維甲酸(retinoic acid,RA)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)對BMSCs進行誘導(dǎo)分化;自然分化組,加入1%血清自然分化;對照組,不加誘導(dǎo)因子,按前方法繼續(xù)培養(yǎng)BMSCs。誘導(dǎo)72h后觀察細(xì)胞形態(tài)變化并進行膽堿能神經(jīng)元特異性標(biāo)志物——膽堿能乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase,ChAT)免疫熒光技術(shù)檢測。 結(jié)果:原代培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)多樣,有大的扁平狀細(xì)胞、蜘蛛狀細(xì)胞和小的圓形細(xì)胞。經(jīng)傳代后,匯合細(xì)胞趨于一致,即小的成纖維樣細(xì)胞和少數(shù)大的扁平細(xì)胞。培養(yǎng)至三代的細(xì)胞幾乎都表達(dá)CD71,陽性率高達(dá)99%。誘導(dǎo)72h后,誘導(dǎo)分化組的細(xì)胞由小梭形狀逐漸變?yōu)榘麧{回縮,有細(xì)長突起的細(xì)胞。ChAT免疫熒光檢測結(jié)果顯示:誘導(dǎo)分化組ChAT陽性率約為15.8%;與其它兩組相比有統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論:經(jīng)體外全骨髓分離培養(yǎng)由貼壁能力純化的細(xì)胞呈均一性,幾乎都表達(dá)CD71,證明培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSCs。BMSCs有向膽堿能樣神經(jīng)元分化的潛能,Shh、RA和bFGF可以在體外誘導(dǎo)BMSCs向膽堿能樣神經(jīng)元的分化。 第二部分Wnt3a在大鼠骨髓源性膽堿能樣神經(jīng)元中的表達(dá) 目的:研究大鼠BMSCs誘導(dǎo)的膽堿能樣神經(jīng)元中Wnt3a的表達(dá)情況,探討Wnt3a在BMSCs向膽堿能樣神經(jīng)元誘導(dǎo)分化過程中的可能作用。 方法:體外分離培養(yǎng)的第三代BMSCs進行分組實驗。實驗共分三組:膽堿能樣神經(jīng)元誘導(dǎo)分化組,自然分化組和對照組。誘導(dǎo)72h后,分別提取各組細(xì)胞總RNA,應(yīng)用半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse-transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)技術(shù)分析Wnt3a在誘導(dǎo)前后細(xì)胞中的表達(dá)變化。結(jié)果用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。 結(jié)果:Wnt3a在膽堿能樣神經(jīng)元誘導(dǎo)分化組中表達(dá)最高,與其他兩組相比有統(tǒng)計學(xué)差異。在自然分化組和對照組中表達(dá)均低,相互之間比較沒有統(tǒng)計學(xué)差別。 結(jié)論:Wnt3a在BMSCs來源的膽堿能樣神經(jīng)元中高表達(dá)。Wnt3a可能參與了BMSCs向膽堿能樣神經(jīng)元的分化,其高表達(dá)可能促進BMSCs向膽堿能樣神經(jīng)元的分化。
[Abstract]:The first part: culture and identification of rat bone marrow mesenchymal stem cells and their differentiation into cholinergic neurons Aim: to isolate bone marrow mesenchymal stem cells (marrow mesenchymal stem cells BMSCs) from rat bone marrow and investigate its biological characteristics. To study the differentiation of BMSCs into cholinergic neurons in vitro. Methods: BMSCs were isolated and cultured in vitro by whole bone marrow culture method. The BMSCs were purified according to the adherent ability of cultured cells. The morphologic changes of BMSCs were observed under phase contrast microscope, and the CD71 immunofluorescence technique was used to detect some of the cells transferred to the third passage. The other part of the cells were divided into three groups: induced differentiation group, induced differentiation of BMSCs by using Hedgehog, retinoic acid (RA) and basic fibroblast growth factor (bFGFs); natural differentiation group, added 1% serum natural differentiation; control group, BMSCs were cultured without induction factor. After 72 hours of induction, cell morphology was observed and immunofluorescence technique was used to detect cholinergic acetyltransferase choline acetyltransferase (Chat), a specific marker of cholinergic neurons. Results: the primary cultured cells had a variety of morphology, including large flat cells, spider cells and small round cells. After passage, the conjunctive cells tend to converge, that is, small fibroblasts and a few large flat cells. Almost all the cells cultured to the third generation expressed CD 71, and the positive rate was as high as 99%. After 72 hours of induction, the cells in the differentiation group gradually changed from spindle shape to cytoplasmic retraction. The results of immunofluorescence detection showed that the positive rate of ChAT was about 15.8in the induced differentiation group, which was significantly different from that in the other two groups. Conclusion: the cells isolated from the whole bone marrow in vitro and purified from adherent ability are homogeneous. Almost all of them expressed CD71, which indicated that the cultured cells had the potential to differentiate into cholinergic neurons by BMSCs.BMSCs. Shhll-RA and bFGF could induce the differentiation of BMSCs into cholinergic neurons in vitro. The expression of Wnt3a in rat bone marrow-derived cholinergic neurons Aim: to investigate the expression of Wnt3a in cholinergic neurons induced by BMSCs in rats and to explore the possible role of Wnt3a in the differentiation of BMSCs into cholinergic neurons. Methods: the third generation BMSCs was isolated and cultured in vitro. The experiment was divided into three groups: cholinergic neuron induced differentiation group, natural differentiation group and control group. After 72 hours of induction, the total RNAs of each group were extracted, and the changes of Wnt3a expression in the cells before and after induction were analyzed by semi-quantitative reverse transcription PCR(reverse-transcription Polymerase Chain reaction assay (RT-PCR). Results the results were analyzed by SPSS software. Results the expression of Wnt3a was the highest in the cholinergic neuron-induced differentiation group, which was significantly different from the other two groups. There was no statistical difference between the two groups. Conclusion the overexpression of Wnt3a in cholinergic neurons derived from BMSCs may be involved in the differentiation of BMSCs into cholinergic neurons, and its high expression may promote the differentiation of BMSCs into cholinergic neurons.
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

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本文編號：1927526