本文選題：重組 + B7-H1��； 參考：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 目的:B7-H1是共刺激分子B7-H1家族成員,B7-H1主要通過其IgV樣區(qū)與受體PD-1結(jié)合發(fā)揮免疫抑制作用,參與腫瘤的免疫逃逸。近年來的研究表明,阻斷B7-H1,可以顯著的抑制腫瘤的生長。本實(shí)驗(yàn)室先前構(gòu)建了重組人B7-H1IgV蛋白,檢測免疫該蛋白小鼠的抗血清活性及蛋白疫苗對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用,表明重組人B7-H1IgV蛋白疫苗既可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗B7-H1抗體和腫瘤特異性的細(xì)胞免疫,又能協(xié)同其它腫瘤疫苗發(fā)揮的抗腫瘤作用。為了進(jìn)一步加快該制品的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),本課題擬通過全面檢定工程菌,建立穩(wěn)定的重組人B7-H1IgV工程菌菌種庫,并建立穩(wěn)定的發(fā)酵純化生產(chǎn)工藝。方法:首先,通過對(duì)重組人B7-H1IgV工程菌進(jìn)行重組質(zhì)粒酶切鑒定和序列分析、IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)水平的檢測、連續(xù)傳代50代的工程菌每隔10代進(jìn)行攜帶質(zhì)粒及其表達(dá)目的蛋白穩(wěn)定性的檢測,形態(tài)學(xué)的電鏡觀察,革蘭氏染色檢定和生化反應(yīng)的檢定,建立穩(wěn)定可靠的工程菌菌庫;然后依次通過5L發(fā)酵罐連續(xù)三批工程菌的發(fā)酵,裂菌,包涵體溶解,建立穩(wěn)定的發(fā)酵工藝,再通過目的蛋白的復(fù)性,兩次Ni親和層析純化,建立穩(wěn)定可靠的純化工藝;最后通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)生產(chǎn)的目的蛋白的免疫原性,抑瘤活性進(jìn)行檢測。結(jié)果:工程菌重組質(zhì)粒的酶切和測序結(jié)果與預(yù)期一致,目的蛋白表達(dá)量達(dá)到10%以上,工程菌連續(xù)傳50代,每隔10代的工程菌質(zhì)粒酶切結(jié)果和目的蛋白表達(dá)水平均一致,電鏡結(jié)果顯示工程菌呈明顯的大腸桿菌形態(tài),且無其它微生物的污染,革蘭氏染色結(jié)果顯示工程菌呈革蘭氏陰性,各項(xiàng)生化反應(yīng)檢定結(jié)果表明工程菌為大腸桿菌。5L發(fā)酵罐連續(xù)發(fā)酵3批工程菌均可得到約190克濕菌,且各批菌表達(dá)目的蛋白水平均在10%以上。添加GSH/GSSG氧化還原系統(tǒng)參與蛋白復(fù)性,顯著提高了復(fù)性過程目的蛋白的可溶性,兩次Ni親和層析純化目的蛋白,純度達(dá)到95%以上。B7-H1IgV蛋白免疫小鼠,兩周內(nèi)抗B7-H1的抗血清可達(dá)到1×104以上,B7-H1IgV能夠顯著抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長,抑瘤率達(dá)到30%。結(jié)論:重組人B7-H1IgV工程菌穩(wěn)定可靠,發(fā)酵和純化生產(chǎn)工藝簡單,穩(wěn)定,經(jīng)濟(jì),生產(chǎn)制備的蛋白疫苗抑瘤活性強(qiáng)。本研究結(jié)果為重組人B7-H1IgV蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)和系統(tǒng)的臨床試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective: B7-H1, a member of the B7-H1 family of costimulatory molecules, plays an immunosuppressive role by binding its IgV like region to the receptor PD-1, and participates in the immune escape of the tumor. Recent studies have shown that blocking B _ 7-H _ 1 can significantly inhibit tumor growth. The recombinant human B7-H1IgV protein was previously constructed in our laboratory to detect the antiserum activity of immunized mice and the inhibitory effect of protein vaccine on tumor growth in tumor-bearing mice. The results showed that the recombinant human B7-H1IgV protein vaccine could not only induce specific anti-B7-H1 antibody and tumor-specific cellular immunity, but also cooperate with other tumor vaccines. In order to speed up the industrial production of the product, this paper intends to establish a stable recombinant human B7-H1IgV engineering strain bank and establish a stable fermentation and purification production process through the comprehensive identification of engineering bacteria. Methods: firstly, the recombinant plasmid was digested and sequenced to detect the expression level of recombinant human B7-H1IgV. A stable and reliable engineering bacterial library was established by detecting the stability of the plasmid carrying plasmid and its expressed target protein, observing the morphology by electron microscope, detecting the Gram staining and biochemical reaction of the engineering bacteria from 50 successive passages every 10 generations. Then, three batches of engineering bacteria were fermented in 5L fermenter in succession, the bacteria and inclusion bodies were dissolved, a stable fermentation process was established, and then the stable and reliable purification process was established by renaturation of the target protein and purification by two Ni affinity chromatography. Finally, the immunogenicity and antitumor activity of the target protein were detected by animal experiments. Results: the results of enzyme digestion and sequencing of recombinant plasmids of engineering bacteria were consistent with expectations. The expression of target protein was more than 10%, and the expression level of target protein was the same as that of plasmids digested every 10 generations. The results of electron microscope showed that the engineering bacteria showed obvious form of Escherichia coli and no contamination by other microbes. The results of Gram staining showed that the engineering bacteria were gram-negative. The results of various biochemical reactions showed that the engineering bacteria were E. coli. 5L fermenting continuously for 3 batches, about 190 grams of wet bacteria could be obtained, and the expression level of target protein of each batch of bacteria was more than 10%. Adding GSH/GSSG redox system to the protein renaturation significantly increased the solubility of the target protein. The purified protein was purified by twice Ni affinity chromatography, and the purity of the protein was over 95%. B7-H1 IgV protein was immunized in mice. Within two weeks, the antiserum against B7-H1 could reach more than 1 脳 10 ~ 4 B7-H1 IgV, which could significantly inhibit the tumor growth of tumor-bearing mice, and the tumor inhibition rate was 30%. Conclusion: the recombinant human B7-H1IgV engineering strain is stable and reliable, the production process of fermentation and purification is simple, stable and economical, and the protein vaccine has strong anti-tumor activity. The results laid a foundation for mass production of recombinant human B7-H1IgV protein and systematic clinical trial.
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392;Q819

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8 魏n

本文編號(hào)：1927482