本文選題：人呼吸道合胞病毒 + 微型復制子�。� 參考：《安徽醫(yī)科大學》2009年碩士論文

【摘要】： 目的:人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus,RSV)廣泛分布于世界各地,是導致嬰幼兒嚴重下呼吸道感染最重要的病毒病原,目前尚無有效的治療方法。利用RNA病毒反向遺傳學操作獲得的減毒RSV活病毒,具有穩(wěn)定的安全性和良好的免疫原性。為開展RSV反向遺傳學研究奠定基礎,擬先嘗試開展RSV微型復制子(minireplicon)構(gòu)建及功能的初步研究。RSV微型復制子一般包括RSV病毒前導序列(Leader, genomic promoter, Le)、轉(zhuǎn)錄起始信號(gene start, GS)、可插入外源基因的多克隆酶切位點(mutiple cloning site, MCS)、轉(zhuǎn)錄終止信號(gene end, GE)和尾隨序列(Trailer, antigenomic promoter, Tr)。通過引入T7 RNA多聚酶(T7 RNA polymerase, T7 RNP)啟動子、克隆入載體px8δT等多步操作,可獲得RSV微型復制子質(zhì)粒,經(jīng)轉(zhuǎn)染可提供T7 RNP及RSV復制所必須的全部蛋白的細胞,可了解RSV微型復制子能否實現(xiàn)RSV基因組的復制和轉(zhuǎn)錄功能。本研究在于構(gòu)建和表達RSV復制必須的兩種重要功能蛋白大蛋白( Large protein,L )和轉(zhuǎn)錄延長/轉(zhuǎn)錄終止抑制因子(transcription elongation/antitermination factor,M2 ORF 1 protein,M2-1),結(jié)合先前構(gòu)建的RSV微型復制子質(zhì)粒等,完成RSV微型復制子質(zhì)粒功能的初步研究。 方法:此前我們?nèi)斯ず铣闪撕琑SV Le、GS、MCS、GE和Tr的GSGE基因片段,PCR方法分別在GSGE片段的5′和3′端引入T7RNA多聚酶啟動子獲得GSGE1及GSGE2片段,并分別克隆入載體px8δT,獲得RSV微型復制子質(zhì)粒px8δT/GSGE1和px8δT/GSGE2,進一步將增強型綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)開放讀碼框(Open Reading Frame, ORF)分別克隆入px8δT/GSGE1和px8δT/GSGE2 ,獲得RSV微型復制子重組質(zhì)粒px8δT/GSGE1/EGFP和px8δT/GSGE2/EGFP。本研究中我們構(gòu)建了可表達兩種核殼體蛋白或聚合酶蛋白的真核表達質(zhì)粒,包括表達L蛋白的質(zhì)粒pcDNA3.1/L及表達M2-1蛋白的質(zhì)粒pcDNA3.1/M2-1。通過脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染RSV微型復制子重組質(zhì)粒及核殼體蛋白質(zhì)粒(包括先期構(gòu)建的可表達RSV核蛋白(nucleoprotein, N)及磷蛋白(phosphoprotein, P)的質(zhì)粒, pcDNA3.1/N和pcDNA3.1/P)至可表達T7 RNA多聚酶(T7 RNA polymerase, T7 RNP)的BSR T7/5細胞系,倒置熒光顯微鏡及流式細胞儀分析EGFP的表達情況。 結(jié)果:經(jīng)限制性內(nèi)切酶分析及核酸序列分析,證明成功構(gòu)建了pcDNA3.1/L和pcDNA3.1/M2-1,經(jīng)RT-PCR及western blot分析證實L及M2-1蛋白有表達,五質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR T7/5細胞,倒置熒光顯微鏡及流式細胞儀均觀察到綠色熒光。 結(jié)論:成功克隆A亞型RSV Long株L和M2-1基因,并在真核細胞中獲得表達。構(gòu)建的RSV微型復制子具有轉(zhuǎn)錄和復制功能,為進一步的RSV反向遺傳操作奠定了基礎。
[Abstract]:Objective: human Respiratory Syncytial virus (Respiratory Syncytial) is widely distributed all over the world. It is the most important viral pathogen leading to severe lower respiratory tract infection in infants. The live attenuated RSV virus obtained by reverse genetic operation of RNA virus has stable safety and good immunogenicity. To lay the foundation for the research of RSV reverse genetics, A preliminary study on the construction and function of minireplicon.RSV microreplons generally include the leading sequence of RSV virus, genomic promoter, Leer, transcriptional initiation signal, gene startand glutathione, and the polyclonal digesting site of foreign gene, named mutiple cloning. Site, MCSA, transcriptional termination signal gene end, GE) and trailer, antigenomic promoter, Tran. By introducing T7 RNA polymerase T7 RNA polymerase (T7 RNA polymerase) promoter and cloning into vector px8 未 T, the microreplicon plasmid of RSV can be obtained. After transfection, the cells that can provide all the proteins necessary for T7 RNP and RSV replication can be transfected. It is possible to understand whether RSV microreplicators can replicate and transcribe RSV genomes. The purpose of this study was to construct and express two important Large proteins (Large protein L) and transcription elongation/antitermination factor-M 2 ORF 1 protein (M2-1), which are necessary for RSV replication, and to combine with previously constructed RSV microreplicon plasmids. The function of RSV microreplicon plasmid was studied. Methods: previously, we artificially synthesized GSGE gene fragments containing RSV LeGS-GSGS-C GE and Tr to obtain GSGE1 and GSGE2 fragments by introducing T7RNA polymerase promoter into 5 'and 3' end of GSGE fragment, respectively. The RSV microreplicon plasmids px8 未 T/GSGE1 and px8 未 T / GSGE2 were cloned into the vector px8 未 T, respectively. The enhanced green Green Fluorescent Protein, EGFP) open reading frame was further cloned into px8 未 T/GSGE1 and px8 未 T/GSGE2, respectively, and the RSV microreplicon recombination plasmids px8 未 T/GSGE1/EGFP and px8 未 Tr GSGE2EGFPwere obtained. In this study, we constructed eukaryotic expression plasmids expressing two nuclear shell proteins or polymerase proteins, including plasmid pcDNA3.1/L expressing L protein and plasmid pcDNA3.1% M2-1 expressing M2-1 protein. Co-transfection of RSV microreplicon recombinant plasmid and nuclear shell protein particles (including previously constructed plasmids expressing RSV nucleoprotein (N) and phosphoprotein (P) by liposome method, pcDNA3.1/N and pcDNA3.1 / P) to express T7 RNA polymerase T7 RNA polymerase, T7 BSR T7 / 5 cell line, The expression of EGFP was analyzed by inverted fluorescence microscope and flow cytometry. Results: pcDNA3.1/L and pcDNA3.1 / M2-1 were successfully constructed by restriction endonuclease analysis and nucleic acid sequence analysis. The expression of L and M2-1 proteins was confirmed by RT-PCR and western blot analysis. The five plasmids were co-transfected into BSR T7 / 5 cells. Green fluorescence was observed by inverted fluorescence microscope and flow cytometry. Conclusion: the L and M2-1 genes of subtype A RSV Long strain were cloned and expressed in eukaryotic cells. The constructed RSV microreplicon has the functions of transcription and replication, which lays the foundation for further reverse genetic manipulation of RSV.
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R373

【共引文獻】

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本文編號：1927199