本文選題：水痘-帶狀皰疹病毒 + 報(bào)告細(xì)胞系　； 參考：《福建醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 【目的】 構(gòu)建水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)ORF62表達(dá)質(zhì)粒,并應(yīng)用VZV報(bào)告細(xì)胞系MV9G定量帶細(xì)胞病毒(CAV),以建立篩選抗VZV藥物并研究其作用機(jī)制的新方法。 【方法】 1、以VZV疫苗株BKvOka基因組DNA為模板、PCR擴(kuò)增獲得ORF62全序列后克隆到高效表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS中構(gòu)建BKvOka ORF62表達(dá)質(zhì)粒pCAG-BKvOka62,再應(yīng)用雙酶切和DNA測(cè)序法鑒定所構(gòu)建質(zhì)粒的正確性。 2、將倍比稀釋的BKvOka株感染MeWo細(xì)胞(含BKvOka株CAV)與MV9G細(xì)胞共培養(yǎng)72h后,分別用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)BKvOka株CAV激發(fā)MV9G細(xì)胞表達(dá)的螢火蟲熒光素酶(RLU)、用間接免疫酶法染色并計(jì)數(shù)病毒蝕斑(focus numbers)、用SYBR Green熒光定量PCR法檢測(cè)病毒DNA拷貝數(shù)(DNA copies),分別計(jì)算RLU/病毒蝕斑數(shù)和RLU/病毒DNA拷貝數(shù)的比值,分析其相關(guān)性,并建立RLU-病毒蝕斑數(shù)、RLU-病毒DNA拷貝數(shù)和病毒DNA拷貝數(shù)-病毒蝕斑數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在培養(yǎng)基中加入阿昔洛韋(ACV)以抑制病毒生長,再以相同方法建立ACV作用下RLU-病毒蝕斑數(shù)、RLU-病毒DNA拷貝數(shù)和病毒DNA拷貝數(shù)-病毒蝕斑數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 3、將隨機(jī)稀釋的GSKvOka株感染MeWo細(xì)胞(含GSKvOka株CAV)與MV9G細(xì)胞共培養(yǎng)72h后,仍用上述方法檢測(cè)GSKvOka株CAV激發(fā)MV9G細(xì)胞表達(dá)的螢火蟲熒光素酶(RLU)、病毒蝕斑數(shù)和病毒DNA拷貝數(shù)。再以MV9G細(xì)胞熒光素酶RLU為基數(shù),根據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)所得RLU/病毒蝕斑數(shù)和RLU/病毒DNA拷貝數(shù)比值推算GSKvOka株蝕斑數(shù)和DNA拷貝數(shù),獲得病毒蝕斑數(shù)和病毒DNA拷貝數(shù)預(yù)測(cè)值,并將預(yù)測(cè)值與其實(shí)測(cè)值比較,以驗(yàn)證應(yīng)用MV9G細(xì)胞定量CAV的可行性。 【結(jié)果】 1、通過將BKvOka株ORF62全序列克隆到pCAGGS表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建了VZV ORF62重組表達(dá)質(zhì)粒pCAG-BKvOka62。經(jīng)雙酶切反應(yīng)和DNA測(cè)序鑒定,克隆的ORF62片段與預(yù)期一致,VZV ORF62表達(dá)質(zhì)粒pCAG-BKvOka62得以成功構(gòu)建。 2、將倍比稀釋的BKvOka株CAV與MV9G細(xì)胞共培養(yǎng)72h后,BKvOka株CAV激發(fā)MV9G細(xì)胞表達(dá)的熒光素酶(RLU)與病毒蝕斑數(shù)顯著相關(guān)(r = 0.999, P 0.01)、與病毒DNA拷貝數(shù)顯著相關(guān)(r = 0.974, P 0.01),病毒DNA拷貝數(shù)與病毒蝕斑數(shù)顯著相關(guān)(r = 0.979, P 0.01),RLU/病毒蝕斑數(shù)=181.62,RLU/病毒DNA拷貝數(shù)=1.97×10-4。加入抗病毒藥物ACV后RLU與病毒蝕斑數(shù)顯著相關(guān)(r = 0.991, P 0.01)、與病毒DNA拷貝數(shù)顯著相關(guān)(r =0.971, P 0.01),病毒DNA拷貝數(shù)與病毒蝕斑數(shù)顯著相關(guān)(r = 0.936, P 0.05)。 3、將隨機(jī)稀釋的GSKvOka株CAV與MV9G細(xì)胞共培養(yǎng)72h后,GSKvOka株CAV激發(fā)MV9G細(xì)胞表達(dá)的熒光素酶(RLU)與病毒蝕斑數(shù)顯著相關(guān)(r = 0.992, P 0.01)、與病毒DNA拷貝數(shù)顯著相關(guān)(r = 0.988, P 0.01),病毒DNA拷貝數(shù)與病毒蝕斑數(shù)顯著相關(guān)(r = 0.966, P 0.01)。根據(jù)GSKvOka株CAV激發(fā)MV9G細(xì)胞熒光素酶RLU值推算的病毒蝕斑數(shù)和病毒DNA拷貝數(shù)預(yù)測(cè)值與其實(shí)測(cè)值基本一致。 【結(jié)論】 1、成功構(gòu)建BKvOka株ORF62表達(dá)質(zhì)粒pCAG-BKvOka62,為熒光定量PCR法檢測(cè)VZV DNA提供了質(zhì)粒模板標(biāo)準(zhǔn)品,為進(jìn)一步應(yīng)用VZV報(bào)告細(xì)胞系定量CAV奠定了基礎(chǔ)。 2、以已知量BKvOka株CAV與MV9G細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí),無論是否加入抗病毒藥物ACV,BKvOka株CAV激發(fā)MV9G細(xì)胞表達(dá)的螢火蟲熒光素酶(RLU)與病毒蝕斑數(shù)和病毒DNA拷貝數(shù)均顯著相關(guān)。以未知量GSKvOka株CAV與MV9G細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)CAV激發(fā)MV9G細(xì)胞表達(dá)的熒光素酶(RLU)與病毒蝕斑數(shù)和病毒DNA拷貝數(shù)仍顯著相關(guān)。根據(jù)RLU推算出的病毒蝕斑數(shù)和病毒DNA拷貝數(shù)的預(yù)測(cè)值與其實(shí)測(cè)值基本一致。提示MV9G細(xì)胞與CAV共培養(yǎng)時(shí)受CAV激發(fā)表達(dá)熒光素酶RLU的變化可以反映病毒蝕斑數(shù)和病毒DNA拷貝數(shù)的變化。因此,應(yīng)用MV9G細(xì)胞定量CAV是可行的。 3、應(yīng)用VZV報(bào)告細(xì)胞MV9G定量CAV克服了免疫酶染色法和熒光定量PCR法過程煩瑣、難客觀、易污染等缺點(diǎn),具有簡便、快速、敏感、客觀和高通量的特點(diǎn),為進(jìn)一步建立抗VZV藥物篩選和作用機(jī)制研究方法奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:[Objective]
To construct the ORF62 expression plasmid of varicella zoster virus (VZV) and use VZV to report the cell line MV9G quantitative band virus (CAV), in order to establish a new method for screening anti VZV drugs and to study the mechanism of its action.
[method]
1, the BKvOka genome DNA of the VZV vaccine strain was used as a template. The full sequence of ORF62 was amplified by PCR and then cloned into the high expression plasmid pCAGGS to construct BKvOka ORF62 expression plasmid pCAG-BKvOka62. Then the correctness of the constructed plasmid was identified by double enzyme cutting and DNA sequencing.
2, after co culture of MeWo cells (including BKvOka strain CAV) and MV9G cells and co culture 72h, the fluorescent method was used to detect the luciferase luciferase (RLU) expressed by BKvOka strain CAV, and the virus plaque (focus numbers) was stained and counted by indirect immunization enzyme method. DNA copies, calculated the ratio of the number of RLU/ virus plaque and the DNA copy number of the RLU/ virus, analyzed its correlation, and established the standard curve of the number of RLU- virus plaque, the DNA copy number of the RLU- virus and the number of virus DNA copies - virus plaque. The standard curve of RLU- virus spot number, RLU- virus DNA copy number and virus DNA copy number virus plaque number were used.
3, after the random diluted GSKvOka strain (including GSKvOka strain CAV) and MV9G cells were co cultured with MV9G cells, the fluorescein luciferase (RLU), the number of virus plaque and the DNA copies of the virus, and the number of virus plaque and the DNA copies of the virus were still detected by the above method. The number of virus plaque and the DNA copy number of RLU/ virus calculated the number of GSKvOka plaque and DNA copy number, obtained the number of virus plaque and the predictive value of the DNA copy number of the virus, and compared the predicted value with the actual test value, in order to verify the feasibility of applying the quantitative CAV of MV9G cells.
[results]
1, the recombinant expression plasmid pCAG-BKvOka62. of VZV ORF62 was constructed by cloning the whole sequence of BKvOka strain ORF62 into pCAGGS expression plasmid and identified by the double enzyme digestion reaction and DNA sequencing. The ORF62 fragment of the clone was consistent with the expectation, and the VZV ORF62 expression plasmid was successfully constructed.
2, after co culture of the diluted BKvOka strain CAV and MV9G cells for 72h, the luciferase (RLU) expressed by the BKvOka strain of MV9G cells was significantly correlated with the number of virus plaque (r = 0.999, P 0.01), which was correlated with the DNA copy number of the virus (r = 0.974, 0.01), and the number of virus copying shells was significantly correlated with the number of virus plaque (0.979, 0.01). The number of plaque was =181.62, and the number of RLU/ virus DNA copies =1.97 x 10-4. was significantly correlated with the number of virus plaque (r = 0.991, P 0.01) after ACV was added to the antiviral drug (r = 0.991, P 0.01), which was significantly correlated with the number of DNA copies of the virus (R =0.971, 0.01).
3, after the random dilution of GSKvOka strain CAV and MV9G cells was co cultured for 72h, the luciferase (RLU) expressed by GSKvOka strain MV9G cells was significantly correlated with the number of virus plaque (r = 0.992, P 0.01), which was significantly correlated with the number of viral DNA copies (r = 0.988, 0.01), and the number of copies of the virus was significantly correlated with the number of virus plaque (0.966, 0.01). The predicted number of virus spots and the number of viral DNA copies predicted by KvOka RLU CAV stimulated MV9G cells were basically consistent with the measured values.
[Conclusion]
1, the ORF62 expression plasmid pCAG-BKvOka62 of BKvOka strain was successfully constructed, which provided the standard plasmid template for the detection of VZV DNA by fluorescence quantitative PCR method, which laid the foundation for the further application of VZV to report the quantitative CAV of the cell line.
2, when the known amount of BKvOka strain CAV and MV9G cells were co cultured, whether or not ACV was added to the antiviral drug, the fluorescent firefly luciferase (RLU) expressed by BKvOka strain CAV was significantly correlated with the number of virus plaque and the number of viral DNA copies. LU) is still closely related to the number of virus plaque and the number of DNA copies of the virus. The predictive value of the number of virus plaque and the number of copies of the virus DNA calculated according to RLU is basically the same as that of the actual test. It is suggested that the changes in the CAV stimulated expression of luciferase RLU in co culture of MV9G cells and CAV can reflect the changes in the number of virus plaque and the number of DNA copies of the virus. Therefore, the change of the number of virus plaque and the number of virus DNA copies should be reflected. Therefore, the change of the number of virus plaque and the number of virus DNA copies should be reflected. Therefore, the change of the number of virus plaque and the number of virus DNA copies should be reflected. It is feasible to use MV9G cells to quantify CAV.
3, the application of VZV report cell MV9G quantitative CAV overcomes the shortcomings of the immune enzyme staining and fluorescence quantitative PCR process, which is easy, rapid, sensitive, objective and high throughput. It lays a foundation for the further establishment of anti VZV drug screening and mechanism research methods.
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：1912877