本文選題：白蛋白微泡 + 聚乙烯亞胺　； 參考：《蘇州大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 目的:探討聚乙烯亞胺修飾白蛋白微泡轉(zhuǎn)染真核細胞的方法,從而提高白蛋白微泡轉(zhuǎn)基因效率。 方法:(1)分別將25%人體白蛋白、葡萄糖和甘露醇等按一定的質(zhì)量比置于10 ml瓶中,混合后用超聲振動儀聲振20 S(電壓100 V、電流0.5 A)制得白蛋白微泡(Albumin Microbubbles,AMB);(2)將微泡包裹氣體由空氣換為全氟丙烷氣體,并在微泡組分中添加聚乙二醇,以提高微泡穩(wěn)定性;(3)在微泡組分中添加聚乙烯亞胺,獲得聚乙烯亞胺修飾包裹全氟丙烷氣體微泡(PAMB),通過轉(zhuǎn)染CHO細胞,36 h后消化細胞流式細胞儀檢測GFP陽性細胞比例,最大轉(zhuǎn)基因效率時質(zhì)量比即為最佳白蛋白與聚乙烯亞胺質(zhì)量比;(4)使用納米激光粒度儀和Zeta電位分析儀檢測微泡表面電位;(5)將質(zhì)粒DNA分別與AMB和PAMB按一定的比例混合后,加入SYBR Green,SYBR Green與DNA結(jié)合后可被激發(fā)出綠色熒光,在熒光顯微鏡下觀察,結(jié)合質(zhì)粒DNA的微泡可發(fā)出綠色熒光;如果微泡未與質(zhì)粒DNA結(jié)合則只能看到綠色熒光而無微泡形態(tài);(6)轉(zhuǎn)染CHO, 293T, M231, 293, SK-Hep-1, SKBR-3, MCF-7, COS 8種細胞,使用流式細胞儀檢測GFP陽性細胞比例以比較PEI、白蛋白+PEI、Lipofectamine 2000和PAMB的轉(zhuǎn)基因效率;(7)使用CCK-8試劑盒檢測PEI, Lipofectamine 2000和PAMB細胞毒性及轉(zhuǎn)染后細胞增值能力,細胞活性= PEI組, Lipofectamine 2000組和PAMB組吸光值/未處理組吸光值,細胞增殖指數(shù)=加入轉(zhuǎn)染試劑之前和加入轉(zhuǎn)染試劑作用6 h之后0 h, 24 h, 48 h, 72 h吸光值/加入轉(zhuǎn)染試劑之前吸光值;(8)使用COS細胞比較AMB,SonoVue微泡和PAMB在超聲介導(dǎo)下轉(zhuǎn)基因效率,超聲強度為0.5 W/cm2、1.0 W/cm2和2.0 W/cm2,時間分別為30 S和60 S;(9)探討超聲在微泡轉(zhuǎn)基因中的作用,制備CHO細胞爬片,分別按如下分組加入試劑:①只加入DNA熒光染料NA-Green(不能主動進入細胞);②AMB+DNA+NA-Green;③AMB+DNA+NA-Green+超聲(1.0 W/cm2, 30 S) ;④PAMB+ NA-Green ;⑤PAMB+DNA+NA-Green ;⑥PAMB+DNA+ NA-Green+超聲(1.0 W/cm2, 30 S),37℃、5% CO2培養(yǎng)6 h后吸取培養(yǎng)液,使用PBS沖洗三遍,每孔加入1ml 1%多聚甲醛固定15 min,用PBS沖洗兩遍,然后使用共聚焦熒光顯微鏡觀察拍照。 結(jié)果:(1)將微泡包裹氣體由空氣換為全氟丙烷氣體,并在微泡組分中添加聚乙二醇后,微泡穩(wěn)定性大大提高,半衰期由原來的半小時至數(shù)天延長到6個月;(2)通過轉(zhuǎn)染CHO細胞,得到最佳白蛋白與聚乙烯亞胺的質(zhì)量比為125:1,此時PAMB轉(zhuǎn)染CHO細胞最大效率可達55%左右;(3)納米激光粒度儀檢測顯示: AMB平均直徑1400 nm左右,而PAMB平均直徑在600 nm左右,Zeta電位分析儀檢測結(jié)果示: AMB的表面電位為(-59.28±3.48)mV,而PAMB的表面電位為(-44.56±0.75)mV;(4)結(jié)合質(zhì)粒DNA的微泡(PAMB)在熒光顯微鏡下可發(fā)出綠色熒光, AMB可見大量綠色熒光而未見微泡形態(tài),未添加DNA的PAMB未見熒光;(5)通過8種細胞比較PEI、白蛋白+PEI、Lipofectamine 2000和PAMB的轉(zhuǎn)基因效率,發(fā)現(xiàn)PAMB組明顯高于單純PEI組和白蛋白+PEI組(P0.05),而在293T、COS、SKBR-3和SK-Hep-1細胞PAMB的轉(zhuǎn)基因效率高于Lipofectamine 2000,在CHO、293、M231和MCF-7細胞轉(zhuǎn)基因效率低于Lipofectamine 2000(P0.05),白蛋白+PEI的轉(zhuǎn)基因效率低于單純PEI的轉(zhuǎn)基因效率(P0.05);(6)PEI,PAMB和Lipofectamine 2000均具有細胞毒性,PAMB的細胞毒性低于PEI和Lipofectamine 2000(P0.05),且使用PAMB轉(zhuǎn)染后細胞增殖能力明顯高于使用PEI和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染的細胞(P0.05);(7)通過實施不同強度和時間的超聲,聚乙烯亞胺修飾白蛋白微泡微泡轉(zhuǎn)基因效率在各種強度和時間下均明顯高于白蛋白微泡和SonoVue微泡(P0.05),不同超聲強度和時間下聚乙烯亞胺修飾白蛋白微泡微泡轉(zhuǎn)基因效率在COS和CHO兩種細胞均沒有顯著差異,且與未超聲組相比略有下降,但無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);(8)超聲介導(dǎo)AMB和SonoVue微泡破裂轉(zhuǎn)基因時,質(zhì)粒DNA依靠空化效應(yīng)在細胞膜上形成的微孔進入細胞,而PAMB可攜帶質(zhì)粒DNA主動進入細胞。 結(jié)論:本研究制作的聚乙烯亞胺修飾包裹全氟丙烷氣體微泡可將其攜帶的外源基因轉(zhuǎn)入真核細胞,且體外實驗證實其具有低細胞毒性和較高的轉(zhuǎn)基因效率,是一種有效的體外基因轉(zhuǎn)染方法,為PAMB作為體內(nèi)轉(zhuǎn)基因載體提供實驗依據(jù)。
[Abstract]:Objective : To study the method of transfection of eukaryotic cells with polyethylene imine modified albumin microbubbles .



Methods : ( 1 ) Twenty - five percent of human albumin , glucose and mannitol were placed in a 10 ml bottle according to a certain mass ratio . After mixing , the microvesicles were prepared by using ultrasonic vibration instrument for 20 S ( voltage 100 V , current 0.5 A ) . Cell activity = PEI group , Lipofectamine 2000 group and PAMB group light absorption value / untreated group light absorption value , cell proliferation index = 0 h , 24 h , 48 h , 72 h light absorption value before transfection reagent was added before transfection reagent was added ; ( 8 ) DNA + NA - Green was added ; ( 3 ) PAMB + DNA + NA - Green ; ( 6 ) PAMB + DNA + NA - Green ; ( 6 h ) PAMB + DNA + NA - Green ; ( 1 . 0 W / cm2 , 30 S ) ;



Results : ( 1 ) The efficiency of PAMB transfected CHO cells was higher than that of simple PEI group and albumin + PEI group ( P0.05 ) . However , in the absence of statistical significance ( P0.05 ) ; ( 8 ) The plasmid DNA enters the cell through the micropores formed on the cell membrane by the cavitation effect , while PAMB can carry plasmid DNA to enter the cell .



Conclusion : Polyethylenimine modified by this study can transfer exogenous gene to eukaryotic cell , and in vitro experiments prove that it has low cytotoxicity and high transgene efficiency . It is an effective method of in vitro gene transfection , which provides experimental basis for PAMB as the transgenic vector in vivo .
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R341

【參考文獻】

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2 李經(jīng)忠,王青青,余海,沈芬平,吳萍萍;聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)基因影響因素的測定及其優(yōu)化[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;2004年02期

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本文編號：1908837