本文選題：SIRT1 + NFAT　； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2010年博士論文

【摘要】：目的：研究Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶SIRTI對轉(zhuǎn)錄因子NFAT(Nuclear factor of activated T cells)的作用及下游炎癥基因的表達(dá),探討其對內(nèi)皮細(xì)胞炎癥作用及其機(jī)制。 背景：SIRTI是酵母染色質(zhì)沉默因子(Silent information regulator 2,Sir2)的哺乳動物同源體,屬于Ⅲ類組蛋白去乙�；�。Sir2家族的蛋白從細(xì)菌到人類都具有高度保守性,人Sirtuins是與Sir2具有同源性的一個家族,其中SIRTI是與Sir2同源性最高的一個成員,在許多生命過程,如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、DNA損傷修復(fù)、重組、長壽和基因沉默中都發(fā)揮了重要的作用。近年來的研究表明,SIRT1不僅可以去乙�；M蛋白如組蛋白H3、H4等,而且與很多轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔因子相互作用,調(diào)節(jié)它們的轉(zhuǎn)錄活性。這些轉(zhuǎn)錄因子包括：p53、FOXO家族、NF-kB(P65)、MyoD等；轉(zhuǎn)錄輔因子包括：NcoR、p300、PGC-1a等。最近的研究認(rèn)為SIRT1是血管內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵的調(diào)節(jié)者,它控制著血管生成,血管的收縮和內(nèi)皮功能紊亂等,尤其可能具有抗炎的作用。但在血管內(nèi)皮細(xì)胞中SIRT1確切的抗炎作用以及機(jī)制還不清楚。 轉(zhuǎn)錄因子NFAT家族目前共發(fā)現(xiàn)有5個成員,分別是NFATcl, NFATc2, NFATc3, NFATc4和NFAT5,其中包括NFATc3前四個成員都依賴于鈣信號通路調(diào)節(jié)。NFAT對細(xì)胞因子、生長因子等生理或病理信號發(fā)生應(yīng)答,調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄,參與細(xì)胞的增殖、分化等過程。NFAT在血管系統(tǒng)中主要發(fā)揮功促進(jìn)血管生成和炎癥的功能。在內(nèi)皮細(xì)胞中,NFAT下游炎癥分子例如：COX-2, ICAM-1等在炎癥中發(fā)揮了重要的作用。但在血管內(nèi)皮細(xì)胞中NFAT參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制還不清楚。 材料和方法：本實驗首先用Real-time PCR實驗檢測了PMA/Ionomycin(Io)在內(nèi)皮細(xì)胞中是否誘導(dǎo)炎癥基因的表達(dá)。為了證明NFATc3是否在內(nèi)皮細(xì)胞中被PMA/Io誘導(dǎo)入核和激活,用免疫熒光的方法檢測了PMA/Io處理內(nèi)皮細(xì)胞后NFATc3核轉(zhuǎn)位的改變。為了進(jìn)一步證明NFAT是否介導(dǎo)了由PMA/Io誘導(dǎo)的炎癥基因的表達(dá),用NFAT的抑制劑CsA預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞,再用PMA/Io處理內(nèi)皮細(xì)胞,Real-time PCR實驗檢測了炎癥基因表達(dá)的改變。為了證明SIRT1對PMA/Io誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞NFAT下游炎癥基因表達(dá)的影響,用Real-time PCR和Western blotting (WB)的實驗,在PMA/Io處理的內(nèi)皮細(xì)胞中,過表達(dá)SIRTI或干擾SIRTI的表達(dá),檢測SIRTI對NFAT下游炎癥分子表達(dá)的影響。為了進(jìn)一步證明SIRT1對PMA/Io誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞NFAT下游炎癥基因的表達(dá)的影響,用SIRT1的激活劑resveratrol和抑制劑Sirtinol處理內(nèi)皮細(xì)胞,Real-time PCR實驗檢測了炎癥基因表達(dá)的改變。通過免疫共沉淀的方法,檢測SIRT1與NFATc3之間的相互作用。為了證明SIRT1是否抑制了NFATc3的轉(zhuǎn)錄活性,在HEK293細(xì)胞中通過熒光素酶報告基因?qū)嶒灧椒z測了SIRT1在基礎(chǔ)水平和PMA/Io處理下對NFATc3的轉(zhuǎn)錄活性的影響。為了證明SIRT1是否通過去乙�；疦FATc3而抑制其轉(zhuǎn)錄活性,通過免疫共沉淀的方法,檢測了SIRT1對NFATc3乙�；降母淖�。為了進(jìn)一步證明SIRT1對NFATc3的轉(zhuǎn)錄抑制是否影響了NFATc3與AP-1的相互作用,通過免疫共沉淀的方法,檢測了SIRT1對NFATc3募集AP-1的能力的影響。 結(jié)果：在內(nèi)皮細(xì)胞中,PMA/Io誘導(dǎo)了炎癥基因的表達(dá),而且NFATc3介導(dǎo)PMA/Io誘導(dǎo)的炎癥基因的表達(dá)；腺病毒介導(dǎo)的SIRT1高表達(dá)抑制了PMA/Io誘導(dǎo)的NFAT下游炎癥基因的表達(dá),并且SIRT1的激活劑resveratrol也能夠抑制PMA/Io誘導(dǎo)的NFAT下游炎癥基因的表達(dá),并且SIRT1的抑制劑Sirtinol上調(diào)了NFAT下游炎癥分子的表達(dá)。NFATc3可以和SIRT1相互作用,并且NFATc3 NHR和RHR結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了與SIRT1之間的相互作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)SIRT1可以通過去乙�；种芅FATc3的轉(zhuǎn)錄活性。SIRT1不影響NFATc3募集AP-1的能力；最后研究還發(fā)現(xiàn)PMA/lo可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)SIRT1的表達(dá),這可能是一種細(xì)胞的負(fù)反饋保護(hù)機(jī)制。 結(jié)論：我們首次發(fā)現(xiàn)NFAT可能是SIRT1的一個新的靶分子。SIRT1可以通過去乙�；疦FATc3,從而抑制其轉(zhuǎn)錄活性。在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi),SIRT1可能通過抑制PMA/Io誘導(dǎo)的NFATc3活性,降低了下游炎癥基因的表達(dá)及活性,從而抑制了炎癥反應(yīng)。因此,提高SIRT1的表達(dá)和活性可以作為一個調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),保護(hù)機(jī)體的新手段。
[Abstract]:Objective: To study the effect of class III histone deacetylase (SIRTI) on the transcription factor NFAT (Nuclear factor of activated T cells) and the expression of the downstream inflammatory genes, and to explore the inflammatory effect and mechanism of it on endothelial cells.
Background: SIRTI is a mammalian homologous body of yeast chromatin silencing factor (Silent information regulator 2, Sir2). The proteins belonging to class III histone deacetylase.Sir2 family are highly conserved from bacteria to humans. Human Sirtuins is a family of homology with Sir2, and SIRTI is the highest homology with Sir2. Members have played an important role in many life processes, such as apoptosis, cell cycle, DNA damage repair, recombination, longevity and gene silencing. Recent studies have shown that SIRT1 can not only deacetylate histone, such as histone H3, H4, but also interact with many transcription factors and transcription cofactors to regulate their transcriptional transcription. Activity. These transcription factors include: p53, FOXO family, NF-kB (P65), MyoD, etc.; transcriptional cofactors include NcoR, P300, PGC-1a and so on. Recent studies suggest that SIRT1 is a key regulator of vascular endothelial homeostasis, which controls angiogenesis, vascular contractions and endothelial dysfunction, and is especially likely to have anti-inflammatory effects. The exact anti-inflammatory effect and mechanism of SIRT1 in skin cells are unclear.
There are 5 members of the transcription factor NFAT family, which are NFATcl, NFATc2, NFATc3, NFATc4 and NFAT5, including the first four members of the NFATc3, which are dependent on the calcium signaling pathway to regulate the response of.NFAT to cytokines, growth factors and other physiological or pathological signals, regulate gene transcription, participate in cell proliferation, differentiation and so on. In the vascular system, it is important to play the role of promoting angiogenesis and inflammation. In endothelial cells, the downstream inflammatory molecules of NFAT, such as COX-2, ICAM-1, play an important role in the inflammation, but the regulatory mechanism of NFAT in the inflammatory response is not clear in vascular endothelial cells.
Materials and methods: in this experiment, Real-time PCR test was first used to detect whether PMA/Ionomycin (Io) induced the expression of inflammatory genes in endothelial cells. In order to prove whether NFATc3 was induced and activated by PMA/Io in endothelial cells, the change of NFATc3 nuclear transposition in PMA/Io cells was detected by immunofluorescence. It was further demonstrated whether NFAT mediated the expression of inflammatory genes induced by PMA/Io, pretreated endothelial cells with NFAT inhibitor CsA, and then treated endothelial cells with PMA/Io, and Real-time PCR test detected the changes in the expression of inflammatory genes. In order to prove the effect of SIRT1 on the expression of inflammatory genes downstream of PMA/Io induced endothelial cell NFAT, Real-t, using Real-t. IME PCR and Western blotting (WB) experiments, in PMA/Io treated endothelial cells, overexpress SIRTI or interfere with the expression of SIRTI to detect the effect of SIRTI on the expression of inflammatory molecules downstream of NFAT. The agent Sirtinol treated the endothelial cells, and the Real-time PCR test detected the changes in the expression of the inflammatory genes. The interaction between SIRT1 and NFATc3 was detected by immunoprecipitation. In order to prove whether SIRT1 inhibited the transcriptional activity of NFATc3, the fluorescein reporter gene test method was used to detect SIRT1 in the basis of HEK293 cells. The effect of level and PMA/Io on the transcriptional activity of NFATc3. In order to prove whether SIRT1 inhibits its transcriptional activity through deacetylation of NFATc3, the changes in the level of NFATc3 acetylation by SIRT1 are detected by immunoprecipitation. To further prove whether the SIRT1's transcript inhibition of NFATc3 affects the interaction between NFATc3 and AP-1. The effect of SIRT1 on the ability of NFATc3 to collect AP-1 was detected by CO immunoprecipitation.
Results: in endothelial cells, PMA/Io induces the expression of inflammatory genes, and NFATc3 mediates the expression of PMA/Io induced inflammatory genes, and the high expression of adenovirus mediated SIRT1 inhibits the expression of PMA/Io induced downstream inflammatory genes in NFAT, and SIRT1 activator resveratrol also inhibits the PMA/Io induced downstream inflammatory genes of NFAT. The expression of SIRT1 inhibitor Sirtinol up-regulated the expression of inflammatory molecules in the downstream NFAT,.NFATc3 can interact with SIRT1, and the NFATc3 NHR and RHR domains mediate the interaction with SIRT1. Further studies have found that SIRT1 can inhibit NFATc3 transcriptional activity by deacetylation. Finally, we also found that PMA/lo could induce the expression of SIRT1 in endothelial cells, which may be a negative feedback protection mechanism of cells.
Conclusion: we first found that NFAT may be a new target molecule of SIRT1,.SIRT1, which can deacetylate NFATc3 and inhibit its transcriptional activity. In endothelial cells, SIRT1 may inhibit the expression and activity of the downstream inflammatory genes by inhibiting the NFATc3 activity induced by PMA/Io and thus inhibiting the inflammatory response. Thus, SIRT1 is enhanced. Expression and activity can serve as a new way to regulate inflammation and protect organism.
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R363

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