本文選題：魚精蛋白 + 聚乳酸羥基乙酸��； 參考：《華中科技大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】：近年來,高分子材料聚乳酸羥基乙酸(PLGA)、聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸(PEG-PLGA)因具有良好的生物相容性和生物可降解性而作為多肽、蛋白質(zhì)、質(zhì)粒DNA疫苗的載體,在疫苗載藥系統(tǒng)里成為了研究熱點(diǎn)。納米粒一般是指粒徑10～1000nm的顆粒,PLGA納米粒包裹抗原在注射局部起到儲(chǔ)庫效應(yīng)并增強(qiáng)吞噬細(xì)胞攝取,而PEG-PLGA納米粒則具有良好的透粘膜性能,可用于粘膜免疫疫苗的載體。目前研究表明,在高分子載體表面修飾陽離子可以增強(qiáng)載體的佐劑效應(yīng)以誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。魚精蛋白(PS)是FDA批準(zhǔn)使用的富含精氨酸的帶正電荷蛋白質(zhì),魚精蛋白包覆的PLGA微球作為疫苗載體可以有效誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞活化,但有關(guān)表面包覆魚精蛋白的PLGA納米�；騊EG-PLGA納米粒用于疫苗載體尚無研究報(bào)道。本研究采用魚精蛋白表面包覆PLGA、PEG- PLGA納米粒,探討其對(duì)小鼠骨髓源性樹突細(xì)胞(BMDC)表型、BMDC攝取、BMDC細(xì)胞因子分泌及抗原交叉遞呈作用的影響。完成的主要研究工作有： (1)復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備PLAG納米粒和PEG-PLGA納米粒,采用單因素方法以PLGA為載體材料,以卵清白蛋白(OVA)為模型藥物,并以納米粒粒徑、多分散系數(shù)(PDI)、表面電位、包封率和載藥量為考察指標(biāo),進(jìn)行制備處方的優(yōu)化篩選。當(dāng)藥物濃度為100mg/mL,載體用量為50 mg/mL,內(nèi)水相與有機(jī)相體積比(W1/0)為1：5,有機(jī)相與外水相體積比(O/W2)為1：20,乳化劑PVA濃度為0.5%,超聲乳化功率為600 W時(shí),制備的OVA-PLGA納米粒粒徑303.3±6.1 nm,Zeta電位-7.36±1.02mV,PDI 0.113±0.031,包封率62.46±0.32%,載藥量23.80±0.09%；OVA-PEG-PLGA納米粒粒徑271.4±9.2 nm,Zeta電位-6.04±0.23 mV,PDI 0.311±0.032,包封率61.51±2.9%,載藥量23.51±0.85%。用魚精蛋白分別與制備得到的PLGA納米粒和PEG-PLGA納米粒共同攪拌進(jìn)行表面物理包覆,得到魚精蛋白包覆的OVA-PLGA納米粒(OVA-PLGA/PS)粒徑347.0±10.6 nm,Zeta電位8.01±1.05 mV,PDI 0.144±0.034；魚精蛋白包覆的OVA-PEG-PLGA納米粒(OVA-PEG-PLGA/PS)粒徑341.2±55.8 nm,Zeta電位8.48±3.42 mV,PDI 0.165士0.080。在透射電鏡觀察時(shí),各種納米粒形態(tài)規(guī)整,分散性好。以上包裹OVA的納米粒主要用于研究BMDC吞噬納米粒后表型變化、細(xì)胞因子分泌和交叉遞呈實(shí)驗(yàn)。本研究還按照不同研究目的制備了用于研究BMDC攝取的FITC-OVA-PLGA、FITC-OVA-PEG-PLGA、FITC-OVA-PLGA/PS和FITC-OVA-PEG-PLGA/PS納米粒；用于研究BMDC攝取后細(xì)胞內(nèi)分布的OsO4-PLGA、OsO4-PEG-PLGA、OsO4-PLGA/PS和OsO4-PEG-PLGA/PS納米粒,其Zeta電位在包覆魚精蛋白后均呈由負(fù)到正的轉(zhuǎn)變。 (2)分離、誘導(dǎo)分化BMDC并進(jìn)行形態(tài)學(xué)和表型的鑒定,結(jié)果顯示在粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細(xì)胞介素4(IL-4)聯(lián)合刺激的作用下,骨髓干細(xì)胞成功分化為BMDC,其純度為85～95%(CD11c+)。BMDC培養(yǎng)體系的成功建立為實(shí)驗(yàn)的順利開展提供了重要保障。本研究觀測(cè)了前述各種納米粒對(duì)BMDC表面分子(CD80、CD83、CD86、MHCI、MHCⅡ)表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)OVA-PLGA/PS可以顯著促進(jìn)BMDC表面分子表達(dá)水平的增高,而OVA-PEG-PLGA/PS可顯著促進(jìn)除CD80之外的BMDC表面分子表達(dá)。研究了前述各種納米粒對(duì)BMDC分泌細(xì)胞因子IL-4、IL-10和IL-12p70的作用,發(fā)現(xiàn)OVA-PLGA/PS可以顯著增加BMDC分泌IL-12p70并顯著減少分泌IL-4,而OVA-PEG-PLGA/PS可以顯著增加BMDC分泌IL-4。以上結(jié)果表明,PS包覆對(duì)不同高分子納米粒可能起到不同的刺激BMDC的作用。對(duì)PLGA納米粒而言,PS包覆可以促進(jìn)其誘導(dǎo)BMDC分泌Th1極化細(xì)胞因子(IL12p70),而對(duì)PEG-PLGA納米粒而言,PS包覆主要促進(jìn)其誘導(dǎo)BMDC分泌Th2極化細(xì)胞因子(IL-4)。 (3)通過流式細(xì)胞術(shù)研究了BMDC對(duì)包裹FITC偶聯(lián)OVA各種納米粒的攝取特征。發(fā)現(xiàn)魚精蛋白包覆的PLGA納米粒(FITC-OVA-PLGA/PS、FITC-OVA-PEG-PLGA/PS)可以顯著增強(qiáng)BMDC的攝取,且FITC-OVA-PLGA/PS對(duì)攝取的促進(jìn)作用更加顯著。這種攝取在37℃條件下,隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加,呈時(shí)間依賴性,但在低溫(4℃)時(shí),攝取增加不明顯,說明魚精蛋白包覆納米粒的攝取方式為能量依賴性的內(nèi)吞方式。 (4)通過將高電子密度的OsO4包裹入PLGA、PEG-PLGA納米粒內(nèi),表面包覆(OsO4-PLGA/PS、OsO4-PEG-PLGA/PS)或不包覆魚精蛋白(OsO4-PLGA、OsO4-PEG-PLGA),并使用透射電鏡觀測(cè)經(jīng)BMDC攝取后,納米粒在BMDC內(nèi)細(xì)胞器的分布。研究發(fā)現(xiàn)魚精蛋白包覆的納米粒(OsO4-PLGA/PS、OsO4-PEG-PLGA/PS)正在和BMDC吞噬囊泡壁接觸；而未用魚精蛋白包覆的納米粒(OsO4-PLGA、OsO4-PEG-PLGA)則未觀察到與BMDC吞噬囊泡相互作用的現(xiàn)象。表明魚精蛋白包覆可能通過促進(jìn)納米粒與BMDC吞噬囊泡膜的相互作用而促使納米粒的溶酶體逃逸。 (5)通過CD8+T細(xì)胞B3Z T雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行BMDC對(duì)納米粒包裹OVA的交叉遞呈作用的研究。著重研究了魚精蛋白包覆納米粒(OVA-PLGA/PS和OVA-PEG-PLGA/PS)對(duì)BMDC交叉遞呈的影響,發(fā)現(xiàn)OVA-PLGA/PS的促進(jìn)能力最強(qiáng)。此外,考察了魚精蛋白包覆納米粒在不同劑量、不同孵育時(shí)間下對(duì)BMDC交叉遞呈的影響,發(fā)現(xiàn)OVA-PLGA/PS在濃度50～300μg/mL、孵育時(shí)間2-8 h內(nèi)對(duì)BMDC交叉遞呈的影響分別呈濃度依賴性及時(shí)間依賴性；而OVA-PEG-PLGA/PS在濃度50～400μg/mL、孵育時(shí)間2-10 h內(nèi)對(duì)BMDC交叉遞呈的影響分別呈濃度依賴性及時(shí)間依賴性。 綜上所述,本研究結(jié)果表明魚精蛋白包覆的納米粒(PLGA/PS、PEG-PLGA/PS)可以增加BMDC吞噬、促進(jìn)BMDC成熟、刺激BMDC細(xì)胞因子分泌、增強(qiáng)BMDC對(duì)外源性抗原的交叉遞呈作用,這也表明魚精蛋白包覆納米粒在注射免疫及粘膜免疫途徑中均有作為引起細(xì)胞免疫的疫苗載體的作用。 本研究結(jié)果在一定程度上探討了魚精蛋白包覆納米粒作為疫苗載體的機(jī)制,并為制備陽離子包覆的高分子納米粒疫苗載藥系統(tǒng)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),在本文的研究基礎(chǔ)上,有必要對(duì)魚精蛋白包覆納米粒疫苗轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在體內(nèi)的抗原釋放動(dòng)力學(xué)與組織分布規(guī)律及免疫方式作進(jìn)一步研究。
[Abstract]:Polyglycolic acid ( PLGA ) , polyethylene glycol - poly ( lactic acid ) glycolic acid ( PEG - PLGA ) , as a carrier of peptide , protein and plasmid DNA vaccine , has been a hot spot in vaccine drug delivery system in recent years .


( 1 ) The preparation of PLAG nanoparticles and PEG - PLGA nanoparticles by means of single factor method was carried out with PLGA as carrier material . The particle size , polydispersity index ( PDI ) , surface potential , encapsulation efficiency and drug loading of PLGA were 1 鈭，

本文編號(hào)：1908820