本文選題：BCG + Ag85A　； 參考：《中國醫(yī)科大學》2009年博士論文

【摘要】：目的 今年年初世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2009年全球結(jié)核病控制報告》中指出,目前全球結(jié)核菌感染人數(shù)超過20億,其中結(jié)核病患者或可能發(fā)病者約占1/10。我國約有5.5億人已經(jīng)感染結(jié)核桿菌,現(xiàn)有活動性肺結(jié)核患者約450萬。全世界耐多藥/廣泛耐藥結(jié)核病例數(shù)約為50萬,我國是其中總數(shù)排名前五位的高負擔國家之一。目前卡介苗(BCG)作為唯一臨床使用的疫苗,預防效果并不穩(wěn)定。因此研制新疫苗成為當前結(jié)核病防治的首要任務。 BCG作為一種減毒活疫苗,除用于預防結(jié)核病外,也作為一種強的非特異性細胞免疫刺激劑,用于腫瘤(如膀胱癌等)的治療。研究還證明BCG與動物和人等一些腫瘤細胞間存在著共同抗原。但BCG灌注治療膀胱癌的毒副作用也常使部分患者因不能耐受其副作用而不得不終止BCG灌注治療。 Ag85復合物是由A、B、C三種成分組成,存在于結(jié)核桿菌和BCG等分枝桿菌的細胞壁及培養(yǎng)濾液中。在BCG Ag85的三種成分中Ag85A所占的比例最大,而且多項研究表明Ag85A抗原是一種十分重要的免疫保護性抗原。近年來的研究表明,Ag85A可使小鼠脾CD8~+CTL的細胞毒活性增強,可刺激機體Th1型細胞因子,如IL-2、IFN-γ、TNF-α等的產(chǎn)生水平升高;促進NK細胞、單核-巨噬細胞等對腫瘤細胞的殺傷作用。但由于結(jié)核分枝桿菌生長緩慢,并且需要較復雜生長條件,從細菌菌體中提取Ag85A蛋白易發(fā)生凝集和降解,更難于純化。同時Ag85A作為一種異種蛋白質(zhì)長期使用仍有可能發(fā)生變態(tài)反應等不良反應。1996年Huygen等首次報道用結(jié)核分支桿菌Ag85A編碼基因的質(zhì)粒DNA經(jīng)肌肉接種途徑免疫小鼠,可誘導小鼠產(chǎn)生很強的細胞和體液免疫應答,抵御結(jié)核分支桿菌的攻擊。 自90年代初首次報道應用DNA疫苗進行免疫以來,大量的研究已經(jīng)顯示了DNA疫苗的實際效果和廣闊的應用前景。近些年來已將DNA疫苗的應用研究擴展到了抗感染、抗腫瘤、治療變態(tài)反應性疾病和自身免疫病及降低組織器官移植排斥反應等多個領(lǐng)域。DNA疫苗可經(jīng)多種途徑(如粘膜、皮膚和肌肉等)和采用多種方式(如口服、噴霧和注射等)接種,依據(jù)所含目的基因及表達產(chǎn)物的不同可致機體產(chǎn)生免疫應答上調(diào)或下調(diào)及免疫應答的類型不同。經(jīng)口服進行DNA疫苗接種是一種簡便、易于被人們接受的方式。但口服DNA疫苗在黏膜局部的表達情況和誘導局部的免疫細胞,特別是IEL的變化,目前尚不清楚。為此,我們采用經(jīng)口灌飼的方式給小鼠投與自制的Ag85A DNA疫苗,在觀察腸道局部細胞表達的基礎(chǔ)七,對其誘導的IEL亞群及生物學功能的變化進行了研究,目的是探討經(jīng)口服途徑接種分枝桿菌Ag85A DNA疫苗有否預防和治療效應。 材料與方法 1、重組質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A的構(gòu)建 采用PCR技術(shù)擴增Ag85A基因片段,與真核表達pcDNA3.1/myc-hisA質(zhì)粒載體連接成重組質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A,再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α,于-70℃保存?zhèn)溆谩?2、Ag85A DNA疫苗的制備 采用V-gene無內(nèi)毒素型超純質(zhì)粒DNA制備試劑盒分離純化pcDNA3.1/mychisA-Ag85A重組質(zhì)粒。采用電穿孔轉(zhuǎn)化法將pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到減毒傷寒沙門氏菌ST7207菌苗,經(jīng)大量培養(yǎng)細菌制成由減毒傷寒菌苗攜帶的Ag85ADNA疫苗。 同時將純化的pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A重組質(zhì)粒用脂質(zhì)LipofectamineTM 2000包裹,制成脂質(zhì)體包裹的Ag85A DNA疫苗。 3、動物分組與免疫 檢測Ag85A DNA疫苗誘導小鼠腸IEL亞群的變化:將C57BL/6小鼠隨機分成3組,即重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組和正常對照組。每只鼠免疫3次,前二次免疫間隔10天,后二次免疫間隔14天。重組質(zhì)粒組前二次經(jīng)口灌飼脂質(zhì)體包裹Ag85ADNA疫苗,后一次經(jīng)口灌飼減毒傷寒菌-Ag85ADNA疫苗。同樣方法分別給后二組小鼠口灌飼減毒傷寒菌-pcDNA3.1菌和生理鹽水作為對照。末次免疫后3周檢測IEL亞群。 檢測Ag85A DNA疫苗誘導小鼠腸IEL的生物學功能變化:將C57BL/6小鼠隨機分成3組,即重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組和正常對照組。每只鼠免疫2次,間隔2周。重組質(zhì)粒組經(jīng)口灌飼減毒傷寒桿菌-Ag85A DNA疫苗菌液;空質(zhì)粒組和正常對照組以同樣方法分別經(jīng)口灌飼減毒傷寒桿菌-V1Jns.tPA菌和生理鹽水。末次免疫后的第1、3、6、9和12d處死小鼠進行IEL生物學功能檢測。 4、IEL的分離 去小鼠全部小腸,翻轉(zhuǎn),截成數(shù)段,清洗干凈;加消化液于37℃恒溫振蕩;靜置片刻后,去含游離細胞的上層液通過紗布及玻璃棉柱,再用淋巴細胞分層液分離。 5、IEL細胞亞群的檢測 采用流式細胞分析儀分析測定T細胞亞群。 6、IEL的培養(yǎng) 將IEL調(diào)成所需細胞濃度,加終濃度為5μg/ml Ag85A蛋白孵育48小時,離心收集培養(yǎng)上清液,用于細胞因子的測定。 7、細胞因子的檢測 采用生物活性測定法(依賴細胞株檢測法)檢測IEL培養(yǎng)上清中的IL-2;采用雙抗體夾心ELISA法檢測IFN-γ、IL-4、IL-10和TGF-β。 8、FasL分子表達的檢測 提取IEL總RNA,采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測FasL mRNA的表達。FasLmRNA的表達水平用所測定的擴增產(chǎn)物FasL的電泳條帶密度與β-actin電泳條帶密度的比值表示。 9、細胞毒活性檢測 采用放射核素釋~(51)Cr釋放法。將IEL先用絲裂霉素處理的轉(zhuǎn)染Ag85A cDNA的p815細胞刺激,然后與靶細胞(~(51)Cr標記的P815細胞)共孵育一定時間,用γ計數(shù)儀測定培養(yǎng)上清中的放射活性cpm值。計算細胞毒活性。計算公式:細胞毒活性(%)=(IEL孔釋放cpm值-自然釋放孔cpm值/最大釋放孔cpm值-自然釋放孔cpm值)x100% 10、細胞增殖活性檢測 采用放射性核素[~3H]thymidine攝入法檢測IEL的增殖活性。將IEL用終濃度為5μg/mlAg85A蛋白刺激培養(yǎng),培養(yǎng)過程中加入[~3H]thymidine,將培養(yǎng)的細胞收集細胞至玻璃纖維濾膜上,將玻璃纖維濾膜放入液體閃爍液內(nèi),用β液體閃爍計數(shù)儀測定cpm值。計算刺激指數(shù)公式:刺激指數(shù)=實驗孔cpm值-空白對照孔cpm值/空白對照孔cpm值。 11、腸組織SIgA水平測定 采用SIgA放免分析試劑盒測定腸組織SIgA水平。剪取小腸中段約5cm,縱行剖開,洗凈剪碎,每克腸組織加入10ml生理鹽水,制成勻漿,離心取上清液。然后按說明書進行測定。 結(jié)果 1、轉(zhuǎn)化pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A和pcDNA3.1/myc-hisA減毒傷寒沙門氏菌成功。 2、IEL亞群的檢測結(jié)果 流式細胞分析技術(shù)檢測結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒組的CD3~+IEL數(shù)量為(5.89±1.15)x10~6,空質(zhì)粒組為(5.55±0.97)x10~6,正常對照組為(5.32±1.10 x10~6)。各組間未見明顯差異(P0.05)。重組質(zhì)粒組的CD3~+CD4~+IEL比例為39.65±5.46%,空質(zhì)粒組為39.78±4.32%,正常對照組為38.92±3.46%。各組間未見明顯差異(P0.05)。重組質(zhì)粒組的CD3~+CD8αβ~+IEL和CD3~+CD8αα~+IEL比例分別為27.25±1.98%和50.75±4.82%,較空質(zhì)粒組(21.37±3.82%和41.08±3.98%)和正常對照組(19.80±0.82%和39.35±4.32%)均見明顯差異(P0.05)。重組質(zhì)粒組的TCRαβ~+IEL比例為42.73±2.25%,空質(zhì)粒組為44.24±2.01%,正常對照組為42.38±1.34%。各組間未見明顯差異(P0.05)。重組質(zhì)粒組的TCRγδ~+IEL比例為38.21±2.82%,較空質(zhì)粒組(32.08±0.98%)和正常對照組(31.35±4.32%)均見明顯差異(P0.05)。CD40L~+IEL和CD45~+IEL亞群的檢測結(jié)果各組間未見明顯差異(P0.05)。FasL~+IEL亞群的檢測結(jié)果,重組質(zhì)粒組較空質(zhì)粒組和正常對照組顯著降低,P0.01,后二組間未見明顯差異。CD103~+IEL亞群的檢測結(jié)果,重組質(zhì)粒組較空質(zhì)粒組和正常對照組顯著升高,P0.01,后二組間未見明顯差異。CD25~+IEL和Foxp3~+IEL亞群的檢測結(jié)果,重組質(zhì)粒組較空質(zhì)粒組和正常對照組顯著降低,P0.01,后二組間未見明顯差異。CD19~+IEL亞群的檢測結(jié)果各組間未見明顯差異(P0.05)。 3、IEL細胞培養(yǎng)上清中細胞因子檢測結(jié)果 采用依賴細胞株生物學活性測定法檢測IEL培養(yǎng)上清中IL-2水平的結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒組小鼠于末次免疫后第6天即出現(xiàn)明顯升高(6679±793cpm),第9天水平最高(10,806±1,293cpm),與空質(zhì)粒組(1,075±186)和正常對照組(308±59)比較差異顯著(P0.01)。用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-4、IL-10和TGF-β水平的結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒組小鼠于末次免疫后第6天IEL的IFN-γ水平(198.78±12.35 pg/ml),與空質(zhì)粒組(75.88±6.03 pg/ml)和正常對照組(53.56±4.85)比較差異顯著(P0.01)。重組質(zhì)粒組第6天IL-10出現(xiàn)明顯升高(35.76±2.78pg/ml),與空質(zhì)粒組(13.98±1.12 pg/ml)和正常對照組比較差異顯著(P0.05)。TGF-β也于第6天達高峰(116.56±2.33 pg/ml),與空質(zhì)粒組(19.54±2.05pg/ml)和正常對照組(21.66±0.88 pg/ml)比較均差異顯著(P0.01)�？召|(zhì)粒組和正常對照組之間IL-10和TGF-β的檢測結(jié)果均未見有意義的差異(P0.05)。IL-4水平在各組間均未見明顯差異(P0.05)。 4、FasL mRNA的表達結(jié)果 通過半定量RT-PCR技術(shù)檢測小鼠iIEL FasL mRNA的表達結(jié)果顯示,末次免疫后第8天,重組質(zhì)粒組FasL mRNA平均表達水平(0.61±0.25),與空質(zhì)粒組(0.28±0.087)和正常對照組(0.19±0.13)均有升高(P0.05);空質(zhì)粒組與正常對照組之間未見有意義的變化(P0.05)。 5、IEL特異性細胞毒活性檢測結(jié)果 檢測末次免疫后第9天IEL特異性細胞毒活性,結(jié)果顯示Ag85A重組質(zhì)粒免疫組IEL細胞毒活性為67.35±5.56%,空載體組為14.89±3.73%和生理鹽水組為10.26±3.3 1%。前組較后2組有顯著增高(P0.05),而后2組組之間也無顯著意義(P0.05)。 6、IEL細胞增殖檢測結(jié)果 應用[~3H]thymidine參入法檢測IEL經(jīng)Ag85A特異性刺激后的增殖活性,結(jié)果顯示測得的cpm值在重組質(zhì)粒組所檢測的時間點均有升高,末次免疫后第6天(3608±372)和第9天(3536±298)cpm值更高,與第6天測得的空載體組(598±79)和正常對照組(675±67)比較差異顯著(P0.01),而后2組組之間也無顯著意義(P0.05)。提示IEL經(jīng)Ag85A特異性刺激后的增殖活性顯著升高。 7、腸組織中SIgA產(chǎn)生水平檢測結(jié)果 應用放射免疫法測定小鼠腸組織中SIgA含量,結(jié)果顯示重組質(zhì)粒組SIgA的含量為0.38±0.05 ng/ml,空質(zhì)粒組為0.24±0.04 ng/ml,正常對照組為0.2±0.09ng/ml。重組質(zhì)粒組較較空質(zhì)粒組和正常對照組為呈現(xiàn)有意義的升(P0.05)。而空質(zhì)粒組和正常對照組之間未見有意義的區(qū)別(P0.05)。 結(jié)論 1、轉(zhuǎn)化pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A和pcDNA3.1/myc-hisA減毒傷寒沙門氏菌成功。 2、經(jīng)口接種Ag85A DNA疫苗誘導了CD3~+CD8αβ~+IEL、CD3~+CD8αα~+IEL、CD3~+TCRγδ~+IEL和CD103~+IEL的比例升高,CD25~+IEL和Foxp3~+IEL比例降低,CD3~+IEL和CD3~+TCRαβ~+IEL的數(shù)量未見明顯變化,提示經(jīng)口途徑投與Ag85A DNA疫苗可能主要誘導CD8~+CTL介導的細胞免疫應答,而不是誘導免疫耐受。 3、經(jīng)口接種Ag85A DNA疫苗可誘導IEL的細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-10和TGF-β分泌水平增加;IL-4水平無變化;特異性細胞毒活性增強;FasL表達增加;IEL特異性增殖活性增強;SIgA分泌水平增加。提示主要誘導Th1型細胞因子介導的細胞免疫應答。
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【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392.11

【參考文獻】

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1 祁贊梅,呂昌龍,劉軍,余憲;小鼠小腸上皮內(nèi)淋巴細胞的提取及鑒定[J];遼寧醫(yī)學雜志;2000年03期

2 劉瀅;張佩;馮永輝;王大南;徐佳;呂昌龍;;Ag85A真核表達重組體的構(gòu)建及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的建立[J];微生物學雜志;2009年01期

3 呂昌龍,祁贊梅,方芳,劉軍,那立新,呂超,李宗喜;實驗性消化道潰瘍的iIEL及其亞群(Thy1~-)的T_H1型細胞因子水平變化及細胞毒活性[J];中華微生物學和免疫學雜志;2003年09期

4 劉北星,呂昌龍;實驗性消化道潰瘍上皮淋巴細胞毒活性的變化[J];中國免疫學雜志;1999年03期

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本文編號：1885798