發(fā)布時間：2018-05-03 16:31

  本文選題：呼腸病毒 + 凋亡��； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2008年博士論文

【摘要】： 2003年7月本實驗室從SARS患者標(biāo)本中分離得到1株新型呼腸病毒BYD1株[1]。這是繼1982年國內(nèi)報道分離出呼腸病毒21年后再次分離得到呼腸病毒[2]。與人類疾病相關(guān)的呼腸病毒以往曾經(jīng)在嬰兒和兒童病患體內(nèi)分離得到,患者出現(xiàn)了致死性腦炎、致死性肺炎、間歇性發(fā)熱、腹瀉等癥狀[3,4,5,6]。盡管如此,一般認(rèn)為該病毒對成人不致病,僅能造成隱性感染,沒有明顯臨床癥狀。長期以來國內(nèi)對該病毒研究甚少,已有的臨床病例和基礎(chǔ)研究的報道基本來自國外。自SARS患者標(biāo)本中分離出BYD1株病毒后,已引起國內(nèi)對該病毒的注意[7],同時本實驗室對BYD1株病毒也開展了一系列研究[8,9,10]。 呼腸病毒與致病性相關(guān)的重要特征是某些毒株能夠在體外誘導(dǎo)多種細胞系凋亡[11,12,13]。本論文將對BYD1株病毒誘導(dǎo)細胞凋亡的能力、誘導(dǎo)凋亡的分子機制、病毒致病性及凋亡和致病性之間的關(guān)系進行研究。 本研究用105TCID50的BYD1株病毒感染HeLa細胞,12h后用胰酶消化細胞致單個,采用碘化丙啶(PI)和異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白(Annexin-V)對感染細胞進行染色,然后經(jīng)流式細胞儀檢測細胞凋亡率。通過成組資料的t檢驗分析,BYD1株病毒感染的HeLa細胞凋亡率為14.32±0.71,模擬感染細胞凋亡率為4.06±0.23,t值為26.69,大于t0.05。分析表明BYD1株病毒具有誘導(dǎo)細胞凋亡能力。 呼腸病毒在宿主細胞內(nèi)復(fù)制一代所需時間不超過16小時[14],但本研究發(fā)現(xiàn)BYD1株病毒顆粒對凋亡的誘導(dǎo)早在感染后12小時就可以檢測到,因此推測病毒對細胞凋亡的誘導(dǎo)發(fā)生在病毒復(fù)制完成之前。凋亡的發(fā)生可能不是由于病毒顆粒的復(fù)制,而是與病毒的某些蛋白分子有關(guān)。有研究指出,呼腸病毒結(jié)構(gòu)蛋白σ1和μ1具有病毒誘導(dǎo)細胞凋亡的能力。μ1、σ3和σ1是呼腸病毒重要的外衣殼蛋白成份,它們參與病毒入侵宿主細胞的過程:呼腸病毒通過類似受體介導(dǎo)的內(nèi)吞方式入侵到細胞漿后,σ3蛋白被降解。感染性亞病毒顆粒(infectious subvirion particles,ISVPs)形成,σ1蛋白構(gòu)象隨之發(fā)生改變,μ1蛋白也被裂解為與病毒顆粒相連的δ和φ片段[15,16,17]。然后病毒釋放出完整的病毒核心,在胞漿中開始子代病毒復(fù)制。 為研究BYD1株病毒引起細胞凋亡的分子機制,本研究選取σ1全長基因、μ1全長基因、以及δ和φ基因片段,將其克隆到真核表達載體pEGFP-C3中,構(gòu)建成重組質(zhì)粒pEGFP-C-σ1(1-461)、pEGFP-C-μ1(1-708)、pEGFP-C-μ1(1-675)和pEGFP-C-μ1(582-708)。然后將每一個重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細胞。于轉(zhuǎn)染后18h觀察細胞病變狀態(tài);與轉(zhuǎn)染后18h收獲細胞用于細胞凋亡率的檢測;于轉(zhuǎn)染后48h收獲細胞,用于電鏡下的形態(tài)學(xué)分析。轉(zhuǎn)染后18h,在普通光鏡下可見宿主細胞出現(xiàn)明顯病變,細胞邊界不清楚、細胞皺縮、甚至破碎。同一病變細胞在熒光顯微鏡下可見有融合蛋白的表達。轉(zhuǎn)染后48h,電鏡形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)細胞出現(xiàn)了典型凋亡特征,可觀察到處于凋亡早期、中期和晚期的細胞。用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染18h的細胞凋亡率,并進行統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)BYD1株病毒σ1蛋白、μ1蛋白、以及μ1(1-675)和φ片段都具有誘導(dǎo)細胞凋亡的能力。實驗結(jié)果顯示,σ1蛋白、μ1蛋白、以及μ1(1-675)和φ片段是BYD1株病毒誘導(dǎo)細胞凋亡的重要決定因子,這些蛋白單獨或相互作用來起始凋亡信號。 為研究新型呼腸病毒BYD1株的致病性與細胞凋亡的關(guān)系,本研究通過顱腔注射方式使2日齡乳鼠感染BYD1株病毒。每只乳鼠注射病毒原液20μl,逐日觀察乳鼠發(fā)病情況。表征觀察,乳鼠病程經(jīng)歷了急性發(fā)病期、緩和期以及癥狀二次加重的變化過程。 在注射病毒后第8天處死動物,取出臟器,制成石蠟包埋組織切片,對組織切片進行組織病理分析和TUNEL法原位凋亡檢測。結(jié)果顯示,BYD1株病毒感染可對乳鼠中樞神經(jīng)、心臟和肺等全身多臟器產(chǎn)生損害,新型呼腸病毒BYD1株的感染與動物中樞神經(jīng)損傷、心肌炎和肺炎的發(fā)病關(guān)系密切;TUNEL法原位細胞凋亡檢測,感染乳鼠海馬組織可見大量凋亡細胞,說明BYD1株病毒誘導(dǎo)的細胞凋亡是造成組織損傷的一個直接原因。
[Abstract]:A novel reovirus BYD1 strain was isolated from SARS patients in July 2003 . It was reported in 1982 that the reovirus was isolated again after 21 years of isolation of reovirus . In the past , the virus has been isolated from SARS patients . It has been reported that the virus can only cause recessive infection and has no obvious clinical symptoms .


In this paper , we will study the relationship between the ability of BYD1 strain to induce apoptosis , the molecular mechanism of inducing apoptosis , the pathogenicity of the virus and the relationship between apoptosis and pathogenicity .


The apoptosis rate of HeLa cells infected by BYD1 strain was 14.32 鹵 0.71 , the apoptosis rate of HeLa cells infected by BYD1 was 14.32 鹵 0.71 , the apoptosis rate of infected cells was 4.06 鹵 0.23 , t value was 26.69 , which was more than t0 . 05 . It was indicated that BYD1 strain had the ability to induce apoptosis .


It is suggested that the induction of apoptosis by BYD1 strain is not due to replication of virus particles , but it is related to certain protein molecules of the virus .


In order to study the molecular mechanism of cell apoptosis induced by BYD1 strain , we selected 蟽1 full - length gene , 渭1 full - length gene , and 未 and 蠁 gene fragments , and then cloned into eukaryotic expression vector ( 1 - 461 ) . After transfection , the cell apoptosis rate was observed . After transfection , the cell apoptosis rate was observed under microscope . The results showed that 蟽1 protein , 渭1 protein , and 渭 1 ( 1 - 675 ) and 蠁 fragment were the important determinants of apoptosis .


In order to study the relationship between the pathogenicity of BYD1 strain and apoptosis of the novel reovirus BYD1 strain , this study was conducted to infect BYD1 strain in 2 - day - old mice by injection of cranial cavity . Each mouse injected 20 渭l of virus stock solution to observe the incidence of neonatal mice .


The results showed that the infection of BYD1 strain could damage the central nervous system , heart and lung of the mice . The results showed that the infection of BYD1 strain could damage the central nervous system , heart and lung of the mice . The infection of BYD1 strain was closely related to the pathogenesis of central nerve injury , myocarditis and pneumonia .

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R373

【參考文獻】

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1 楊怡,李衛(wèi)華,端青,朱虹,郎振為,孟忻,張德添,何昆,周濤,張颯,陳德蕙;再次從SARS患者肺組織中分離與檢出呼腸病毒[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2003年04期

2 蘇裕心,何君,朱虹,宋立華,黃如統(tǒng),端青;新分離呼腸病毒的空斑試驗及病毒純化[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2005年05期

3 宋立華;蘇裕心;何君;朱虹;黃如統(tǒng);端青;;新分離呼腸病毒基因組片段S1全長cDNA克隆及其序列分析[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2006年01期

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本文編號：1839242