發(fā)布時間：2018-04-28 20:32

  本文選題：臍帶血 + 間充質(zhì)干細胞　； 參考：《廣西醫(yī)科大學》2009年碩士論文

【摘要】： 目的將來源于健康產(chǎn)婦的臍帶血進行體外分離、培養(yǎng)出間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs),在特定環(huán)境下誘導成肝樣細胞并進行鑒別,觀察MSCs及肝樣細胞對大鼠慢性肝損傷的修復作用,為終末期肝病的肝細胞移植治療和生物型人工肝提供一種新的細胞來源。 方法采集正常產(chǎn)婦臍帶血,密度梯度離心法和貼壁法分離、培養(yǎng)、純化臍血MSCs;流式細胞儀檢測MSCs表面抗原CD34、CD44表達情況;用肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)及成纖維細胞生長因子-4(Fibroblast growthfactor-4)聯(lián)合誘導P3代的MSCs成肝樣細胞;采用免疫細胞化學法檢測肝樣細胞標志物的表達情況并進行糖原染色檢測細胞糖原表達;采用透射電鏡觀察MSCs和誘導的肝樣細胞的超微結(jié)構(gòu);將MSCs及誘導后的肝樣細胞輸注入慢性肝損傷的大鼠體內(nèi),取肝臟病理,觀察兩者對肝損傷的修復情況。 結(jié)果1.接種的MSCs于48～72h后貼壁,巢樣克隆,梭形,折光性強,3天后梭形細胞體積開始增大,15天后出現(xiàn)梭形細胞集落,呈平行或火焰狀排列或漩渦狀生長,三周后細胞呈80～90%融合;細胞傳至第三代時,呈較均一的長梭形,形態(tài)基本無變化。2.經(jīng)過傳代、純化、誘導的細胞經(jīng)3-4周,呈放射狀的細胞排列結(jié)構(gòu)逐步消失,長梭形細胞變類圓形或多角形,存在離散現(xiàn)象,胞漿出現(xiàn)顆粒,部分出現(xiàn)雙核。3.標志物檢測:非誘導組始終沒有見到肝細胞的標志物白蛋白(albium,ALB)、糖原表達,甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)第0天有少量表達,此后不再表達;誘導組可以檢測到肝細胞的標志物AFP、ALB和糖原的明顯的表達。4.培養(yǎng)至第三代的細胞表面抗原為c D44+/c D34-的細胞占(98.59±4.53)%。5.移植了人MSCs及誘導后的肝樣細胞的大鼠肝損傷病理輕于無治療組,肝樣細胞組的病理損傷輕于MSCs組。 結(jié)論1.使用密度梯度離心法和貼壁法相結(jié)合可以從人臍帶血中成功分離培養(yǎng)出MSCs,經(jīng)過反復換液及傳代培養(yǎng)后可獲得純度較高的MSCs。2.HGF+FGF-4能很好地誘導MSCs成為肝樣細胞。3.40%四氯化碳腹腔注射可以成功造出大鼠慢性肝損傷模型,穩(wěn)定性及重現(xiàn)性好。4.MSCs和誘導后的肝樣細胞均有修復肝損傷的作用,且誘導后的肝樣細胞優(yōu)于MSCs。5.MSCs能通過凍存的方法長期保存。
[Abstract]:Objective to isolate umbilical cord blood from healthy parturient in vitro, culture mesenchymal stem cells, induce hepatoid cells in a specific environment and differentiate them, and observe the repair effect of MSCs and hepatoid cells on chronic liver injury in rats. It provides a new cell source for hepatocyte transplantation and bioartificial liver transplantation in end-stage liver disease. Methods umbilical cord blood was collected from normal parturient, isolated by density gradient centrifugation and adherent method, cultured and purified, and the expression of MSCs surface antigen CD34 and CD44 was detected by flow cytometry. Hepatoblast like cells of P3 generation were induced by hepatocyte growth factor (HGF) and fibroblast growth factor-4 (fibroblast growth factor-4), the expression of hepatocyte markers was detected by immunocytochemistry and glycogen expression was detected by glycogen staining. The ultrastructure of MSCs and induced hepatocytes were observed by transmission electron microscope (TEM), and the MSCs and induced hepatoid cells were injected into the rats with chronic liver injury to observe the repair of liver injury. Result 1. The MSCs inoculated at 48 ~ 72 h followed by adherent, nest-like clone, fusiform, and strong refraction. After 3 days, the fusiform cell volume began to increase. After 15 days, fusiform cell colonies appeared in parallel or flame-like arrangement or whirlpool growth. After 3 weeks, the cells were fused in 80% or 90%. When the cells passed to the third generation, they were more uniform and fusiform, with no change in shape. 2. After passage and purification, the induced cells gradually disappeared after 3-4 weeks, and the long fusiform cells became round or polygonal, with the appearance of granules in the cytoplasm and binuclear. 3. The detection of markers: in the non-induced group, the expression of Albium albium AlBN, glycogen, alpha feto protein (AFP) was not found at day 0, but no expression was found thereafter. In the induction group, the expression of AFPnALB and glycogen in hepatocytes could be detected. 4. The cell surface antigen (cD44 / cD34-) in the third passage was 98.59 鹵4.53. The pathological changes of the transplanted MSCs and induced hepatoid cells were lighter than those of the untreated group, and the pathological damage of the hepatoid cells group was lighter than that of the MSCs group. Conclusion 1. Using density gradient centrifugation combined with adherent method, MSCs can be isolated and cultured from human umbilical cord blood successfully. After repeated fluid exchange and subculture, high purity MSCs.2.HGF FGF-4 can be obtained to induce MSCs into hepatoid cells. 3.40% tetrachlor. The model of chronic liver injury in rats can be established successfully by intraperitoneal injection of carbon. Good stability and reproducibility. 4. MSCs and induced hepatoid cells can repair liver injury, and the induced hepatoid cells are better than MSCs.5.MSCs through cryopreservation for a long time.
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R329;R575

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