本文選題：空腸彎曲菌 + peblA基因��； 參考：《遵義醫(yī)學(xué)院》2009年碩士論文

【摘要】： 目的:構(gòu)建空腸彎曲菌peb1A基因真核表達(dá)載體并在COS-7細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),初步探討重組質(zhì)粒的免疫原性及殼聚糖的免疫佐劑作用。方法:(1)真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定:以PET28a(+)-peb1A為模板,PCR擴(kuò)增空腸彎曲菌peb1A基因,擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pcDNA3.1(-)分別經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切,回收后用T4連接酶連接得到重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-peb1A,轉(zhuǎn)化E.coli DH5α,Amp平板篩選陽性克隆,提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切、PCR和測序鑒定。(2)重組質(zhì)粒在COS-7細(xì)胞中的表達(dá):重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-peb1A經(jīng)抽提后采用jetPEI~(TM)陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,Western Blot鑒定重組蛋白的表達(dá)。(3)重組質(zhì)粒的免疫原性研究:健康雄性昆明小鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組設(shè)pcDNA3.1(-)-peb1A組和殼聚糖-pcDNA3.1(-)-peb1A組,均設(shè)50μg/100μl、100μg/100μl、200μg/100μl(按DNA含量計(jì)算)三個劑量組;對照組設(shè)空載體pcDNA3.1(-)(100μg/100μl)對照組和生理鹽水(NS)對照組。各組均采用小鼠股四頭肌注射法。A方案在第0、10、20天免疫,B方案在第0、15、25、35天免疫,均于每次免疫后第10天采集各組小鼠血清,并分離各組小鼠脾淋巴細(xì)胞包被細(xì)胞培養(yǎng)板。以間接ELISA法檢測血清中IgM、IgG的含量,選擇最佳免疫原劑量和免疫方案。以細(xì)胞ELISA法檢測優(yōu)選組小鼠脾淋巴細(xì)胞CD20、CD21表達(dá)水平。結(jié)果:(1)peb1A基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,為大小約812bp的單一條帶。重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-peb1A經(jīng)雙酶切和PCR鑒定,構(gòu)建正確。peb1A基因測序結(jié)果與GenBank中peb1A基因序列一致。(2)重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,并能在COS-7細(xì)胞表達(dá)重組蛋白。(3)裸DNA組和殼聚糖-DNA組各劑量組IgG水平均高于兩對照組,有顯著性差異(P＜0.05)。裸DNA組和殼聚糖-DNA組IgG水平100μg劑量均高于50μg劑量及200μg劑量,有顯著性差異(P＜0.05)。殼聚糖-DNA組100μg劑量IgG水平高于裸DNA組100μg劑量,有顯著性差異(P＜0.05)。A方案IgG最高水平高于B方案IgG最高水平,有顯著性差異(P＜0.05)。小鼠脾淋巴細(xì)胞CD20、CD21表達(dá)水平,裸DNA組和殼聚糖-DNA組均高于兩對照組,有顯著性差異(P＜0.05),殼聚糖-DNA組高于裸DNA組,有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)論:成功構(gòu)建了空腸彎曲菌peblA基因真核表達(dá)載體并能在COS-7細(xì)胞中表達(dá)。重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-peb1A經(jīng)肌肉注射免疫小鼠,具有較好的免疫原性,最佳免疫原劑量為100μg,A免疫方案優(yōu)于B免疫方案。殼聚糖能增強(qiáng)pcDNA3.1(-)-peblA的免疫原性,有望成為CJ基因疫苗的候選佐劑。
[Abstract]:Aim: to construct eukaryotic expression vector of peb1A gene of Campylobacter jejuni and express it in COS-7 cells. Methods the eukaryotic expression vector was constructed and identified. The peb1A gene of Campylobacter jejuni was amplified by using PET28a as template, and the amplified product and plasmid pcDNA3.1 ~ (-1) were digested by EcoR 鈪，

本文編號：1799537