本文選題：SEA + SEB　； 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種重要的人畜共患致病菌,廣泛存在于自然界中,其產(chǎn)生的腸毒素(staphylococcal enterotoxins, SE)可通過污染食物而導(dǎo)致食物中毒。目前,隨著人們對(duì)食品安全重視度的加深,國(guó)際上已將腸毒素的檢測(cè)列入食品檢驗(yàn)法規(guī),因此建立靈敏、快速的腸毒素檢測(cè)方法,是食品安全檢測(cè)的一項(xiàng)重要研究?jī)?nèi)容。 腸毒素的檢測(cè)方法主要有動(dòng)物學(xué)試驗(yàn)、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法、生物傳感器技術(shù)和超抗原技術(shù)。在這些方法中,免疫學(xué)方法因其具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異性高等特點(diǎn),是檢測(cè)腸毒素廣泛采用的一項(xiàng)技術(shù)。單克隆抗體(monoclonal anibody, McAb)純度高,特異性強(qiáng),一經(jīng)研制出,便可大批量生產(chǎn),將其用于腸毒素的免疫學(xué)檢測(cè)將大大提高檢測(cè)的特異性和靈敏度。商品化腸毒素ELISA檢測(cè)試劑盒中采用的單克隆抗體主要是通過細(xì)胞融合技術(shù),對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單獨(dú)免疫一種抗原所產(chǎn)生的單抗,一次實(shí)驗(yàn)只能檢測(cè)一種腸毒素。已知腸毒素種類多達(dá)20種,葡萄球菌食物中毒往往也不是由單一腸毒素引起的,在實(shí)際檢測(cè)過程中,有時(shí)不需要對(duì)腸毒素血清型作出鑒定,只要判斷有沒有腸毒素存在即可,因此如果一次反應(yīng)能同時(shí)檢測(cè)多種腸毒素將大大減少葡萄球菌食物中毒分析的工作量。為此,采用混合免疫法,篩選制備能同時(shí)針對(duì)多種腸毒素抗原的共同決定簇的單克隆抗體,有可能實(shí)現(xiàn)一次反應(yīng)檢測(cè)多種腸毒素。 本課題以引起葡萄球菌食物中毒比較常見的金黃色葡萄球菌A型和B型腸毒素(staphylococcal enterotoxin A, SEA和staphylococcal enterotoxin B, SEB)作為免疫原,采用混合免疫方法,運(yùn)用雜交瘤技術(shù)制備得到同時(shí)針對(duì)SEA和SEB的單克隆抗體；同時(shí)以SEA單獨(dú)免疫BALB/c小鼠為對(duì)照,經(jīng)同樣的方法,制備得到相應(yīng)的抗SEA單克隆抗體。對(duì)兩種免疫方法制備的單克隆抗體的性質(zhì)進(jìn)行了一系列的分析和比較,并采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA對(duì)混合免疫制備的單抗在金黃色葡萄球菌腸毒素污染的乳制品中腸毒素的檢測(cè)進(jìn)行了初步的應(yīng)用評(píng)價(jià)。主要研究結(jié)果如下： 1抗SEA-SEB多克隆抗體的制備及ELISA分析 采用SEA和SEB兩種抗原等量混合免疫BALB/c小鼠(編號(hào)1～3),免疫劑量為20μg/次/只(SEA和SEB各10μg),在每次免疫后的第7d進(jìn)行采血,得到抗血清。間接ELISA實(shí)驗(yàn)分析表明,免疫小鼠從第21d開始有明顯抗體產(chǎn)生,第49d抗體的效價(jià)達(dá)到較高水平,其中2號(hào)小鼠第四次免疫后的抗血清針對(duì)SEA的效價(jià)為4.5×104,針對(duì)SEB的效價(jià)為5.0×104；抗血清對(duì)SEA的靈敏度為81.3 ng/mL,對(duì)SEB的靈敏度為62.4 ng/mL�？寡鍖�(duì)SEA和SEB都有很強(qiáng)的特異性,與金黃色葡萄球菌C1型腸毒素(SEC1)、牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)均無(wú)交叉反應(yīng)。 同時(shí),采用SEA單獨(dú)免疫BALB/c小鼠(編號(hào)4～6),免疫劑量為10μg/次/只,免疫小鼠從第21d開始有明顯抗體產(chǎn)生,第49d抗體的效價(jià)達(dá)到較高水平,其中4號(hào)小鼠第四次免疫后的抗血清針對(duì)SEA的效價(jià)為5.0×104；抗血清對(duì)SEA的靈敏度為73.9 ng/mL�？寡鍖�(duì)SEA有很強(qiáng)的特異性,與SEB、SEC1、BSA和OVA均無(wú)交叉反應(yīng)。 2抗SEA-SEB單克隆抗體的制備及性質(zhì)分析 采用SEA和SEB混合免疫的2號(hào)小鼠,取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合,經(jīng)間接ELISA篩選和有限稀釋法亞克隆,獲得1株能同時(shí)分泌抗SEA和SEB的雜交瘤細(xì)胞3F2。采用SEA單獨(dú)免疫的4號(hào)小鼠,經(jīng)同樣的方法,獲得1株分泌抗SEA的雜交瘤細(xì)胞3C12。 將2株雜交瘤細(xì)胞分別注射于BALB/c小鼠體內(nèi)生產(chǎn)腹水抗體,用間接ELISA方法對(duì)收集到的抗體的效價(jià)、靈敏度、特異性、親和力、雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目和分泌抗體的穩(wěn)定性等性質(zhì)進(jìn)行了一系列的分析。結(jié)果表明,雜交瘤細(xì)胞3F2所產(chǎn)腹水抗體針對(duì)SEA的效價(jià)為4×105,靈敏度為133.2 ng/mL,親和力常數(shù)為8.18×107L/mol;針對(duì)SEB的效價(jià)為1×105,靈敏度為82.5 ng/mL,親和力常數(shù)為5.32×107L/mol,與SEC1、BSA、OVA等均無(wú)交叉反應(yīng)。雜交瘤細(xì)胞3C12所產(chǎn)腹水抗體針對(duì)SEA的效價(jià)為2×105,靈敏度為115.9 ng/mL,親和力常數(shù)為6.76×107 L/mol,與SEC1、BSA、OVA等均無(wú)交叉反應(yīng),與SEB僅有很微弱的交叉反應(yīng)。 通過對(duì)兩株雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目分析表明,雜交瘤細(xì)胞3F2和3C12的染色體數(shù)都在100條左右,近似等于兩親本細(xì)胞染色體數(shù)目之和,說明得到的雜交瘤細(xì)胞是親本細(xì)胞的融合。2株雜交瘤細(xì)胞經(jīng)連續(xù)傳代6周和三個(gè)月的反復(fù)凍融后,分泌抗體的能力及效價(jià)水平變化不大,表明這兩株雜交瘤細(xì)胞株比較穩(wěn)定。 3抗SEA-SEB單克隆抗體在乳制品檢測(cè)中的初步應(yīng)用 選取易受腸毒素污染的乳制品(牛奶和酸奶)為研究對(duì)象,對(duì)混合免疫制備的單抗3F2在腸毒素檢測(cè)中的應(yīng)用效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。(1)將單一腸毒素SEA或SEB添加到不含腸毒素的牛奶樣品中,分別用單抗3F2、單抗3C12作為檢測(cè)抗體,采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)樣品中腸毒素的回收率進(jìn)行了測(cè)定。3F2對(duì)SEA和SEB都有較好的回收率,對(duì)SEA的平均回收率在88.3%～103.5%之間,對(duì)SEB的平均回收率在86.2%～101.6%之間；3C12對(duì)SEA的平均回收率在86.7%～98.1%之間。(2)將三種不同型別的腸毒素(SEA、SEB和SEC1)進(jìn)行組合,分別添加到不含腸毒素的牛奶樣品中,用混合免疫制備的單抗3F2對(duì)牛奶樣品中的SEA和SEB進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)3F2不受SEC1的干擾,能夠準(zhǔn)確的檢測(cè)到SEA和SEB,并且對(duì)SEA和SEB的平均回收率都在70%～120%之間。(3)將產(chǎn)SEA和SEB的金黃色葡萄球菌菌株,以單一接種和混合接種的兩種方式,接種于不含腸毒素的牛奶和酸奶,放置到37℃條件下培養(yǎng)36～48 h后,用混合免疫制備的單抗3F2檢測(cè)其產(chǎn)生的腸毒素,發(fā)現(xiàn)人工污染樣品中均能檢測(cè)到SEA和SEB。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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