本文選題：卡氏肺孢子菌 + kexin基因�。� 參考：《南通大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】：目的:體外擴(kuò)增大鼠卡氏肺孢子菌kexin基因全長DNA序列,選取具有優(yōu)勢抗原表位的片段構(gòu)建原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白,免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,檢測該蛋白的免疫學(xué)特性。方法:根據(jù)已報(bào)道大鼠卡氏肺孢子菌kexin基因cDNA序列,設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增卡氏肺孢子菌kexin基因全長DNA序列;通過生物信息學(xué)方法選擇具有優(yōu)勢表位的kexin基因片段,通過基因克隆技術(shù)分別構(gòu)建pGEX-kexin及pET-kexin重組表達(dá)質(zhì)粒;用IPTG分別誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白(GST-kexin、His-kexin);將融合蛋白His-kexin經(jīng)透析袋電泳法純化后作為抗原,免疫小鼠,GST-kexin蛋白經(jīng)純化后作為檢測用抗原,測定其免疫指標(biāo)。應(yīng)用western blot鑒定kexin融合蛋白的免疫原性;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測小鼠血清中特異性抗體水平;淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(MTT法)檢測淋巴細(xì)胞增殖水平。結(jié)果:PCR擴(kuò)增kexin基因獲得DNA序列全長為2605bp,成功提交美國NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(序列號(hào)為EU711053)。選取的kexin基因片段分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-kexin及pET-kexin,經(jīng)PCR、酶切及測序等方法鑒定表明兩種表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功,且兩種表達(dá)質(zhì)粒中目的片段完全一致。誘導(dǎo)表達(dá)的GST-kexin蛋白分子量約為43kDa,His-kexin蛋白分子量約為23kDa。以融合蛋白His-kexin免疫小鼠,獲得的小鼠血清,經(jīng)ELISA及western blot分析能夠特異性識(shí)別GST-kexin蛋白。免疫后小鼠脾細(xì)胞經(jīng)GST-kexin蛋白刺激后,His-kexin蛋白免疫組的刺激指數(shù)較對照組顯著增高(分別為1.763±0.164;1.01±0.051)。結(jié)論:本研究成功克隆了kexin基因,構(gòu)建了pGEX-kexin及pET-kexin原核表達(dá)載體,誘導(dǎo)表達(dá)了GST-kexin及His-kexin融合蛋白。His-kexin融合蛋白能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
[Abstract]:Aim: to amplify the full-length DNA sequence of Pneumocystis carinii kexin gene in vitro, construct the prokaryotic expression vector and induce the expression of recombinant protein by selecting the fragment with dominant antigen epitope.Methods: according to the reported cDNA sequence of Pneumocystis carinii kexin gene, primers were designed to amplify the full-length DNA sequence of Pneumocystis carinii kexin gene, and kexin gene fragments with dominant epitopes were selected by bioinformatics.The recombinant expression plasmids of pGEX-kexin and pET-kexin were constructed by gene cloning technique, the fusion protein GST-kexin His-kexinine was induced by IPTG, the fusion protein His-kexin was purified by dialysate bag electrophoresis as antigen, and the GST-kexin protein of immunized mice was purified as detection antigen.Its immune index was determined.Western blot was used to identify the immunogenicity of kexin fusion protein, Elisa was used to detect the specific antibody level in mouse serum, and lymphocyte transformation assay was used to detect lymphocyte proliferation.Results the total length of kexin gene was 2605 BP, which was successfully submitted to the US NCBI GenBank database (sequence number EU711053).The recombinant plasmids pGEX-kexin and pET-kexin were constructed by PCR, restriction endonuclease digestion and sequencing, respectively. The results showed that the two expression plasmids were constructed successfully, and the target fragments of the two plasmids were identical.The molecular weight of the induced expression of GST-kexin protein was about 43kDaHis-kexin protein and the molecular weight of the protein was about 23kDa.Mice were immunized with the fusion protein His-kexin. The obtained serum could specifically recognize the GST-kexin protein by ELISA and western blot analysis.The stimulation index of His-kexin protein immunized group was significantly higher than that of the control group (1.763 鹵0.164 鹵1.01 鹵0.051).Conclusion: kexin gene was cloned successfully, pGEX-kexin and pET-kexin prokaryotic expression vectors were constructed, and GST-kexin and His-kexin fusion protein. His-kexin fusion protein could induce specific humoral and cellular immune responses in mice.
【學(xué)位授予單位】：南通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1773699