本文選題：Endoglin + CD105��； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2008年博士論文

【摘要】： 研究背景:Endoglin又名CD105,是一種細(xì)胞膜糖蛋白,是內(nèi)皮細(xì)胞增殖的標(biāo)志物之一。它在增殖的內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤組織的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中呈過(guò)表達(dá),而在正常成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞中不表達(dá)或弱表達(dá)。Endoglin還是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)受體復(fù)合物的成分之一,具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)TGF的反應(yīng)、促內(nèi)皮細(xì)胞增殖和促血管形成等功能,與腫瘤血管生成有關(guān)。依據(jù)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤新生血管形成的觀點(diǎn),大量研究表明,通過(guò)靶向腫瘤新生血管內(nèi)皮表達(dá)的Endoglin,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)了對(duì)移植瘤的放射免疫顯像和治療作用,證實(shí)了Endoglin可以作為體內(nèi)腫瘤顯像診斷和治療的理想靶標(biāo)。 提高早期卵巢癌檢出率是降低卵巢癌患者高死亡率的關(guān)鍵,但目前尚無(wú)理想的篩查或/和早期診斷卵巢癌的方法,因此建立特異的早期卵巢癌診斷方法顯得尤為迫切和重要。卵巢癌是一高度血管化的惡性腫瘤,所以抗人Endoglin抗體有可能在其診斷及治療中發(fā)揮重要作用。 抗Endoglin抗體的研究中,以單克隆抗體的報(bào)道最多。但是單克隆抗體由于自身的一些缺點(diǎn)使得它的臨床應(yīng)用效果不佳。如單克隆抗體的分子量大,穿透力較弱,因有Fc段,在體內(nèi)容易與正常組織的Fc受體發(fā)生非特異性結(jié)合,多為鼠源性,易致機(jī)體產(chǎn)生人抗鼠抗體反應(yīng),制備過(guò)程煩瑣等。比較而言,單鏈抗體分子小、穿透力強(qiáng)、體內(nèi)清除快、缺乏Fc段、異源性低、易于在大腸桿菌中重組表達(dá)獲得足夠量,易于用基因工程方法制備和修飾,通過(guò)構(gòu)建雙價(jià)或雙特異性單鏈抗體來(lái)增加抗體的穩(wěn)定性和親和力,單鏈抗體是將藥物、毒素和放射性物質(zhì)導(dǎo)向腫瘤的很有價(jià)值的小分子抗體,因而在腫瘤診斷和治療方面的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。 噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù),是利用噬菌體表達(dá)外源基因的一項(xiàng)技術(shù)。它以改建的噬菌體為載體,把目的基因片段定向插入噬菌體外殼蛋白質(zhì)基因區(qū),使外源多肽或抗體表達(dá)并展示于噬菌體表面,進(jìn)而通過(guò)親和富集篩選表達(dá)有特異肽或抗體的噬菌體,然后進(jìn)行DNA序列測(cè)定。它將基因型和表型、分子結(jié)合活性與噬菌體的可擴(kuò)增性結(jié)合在一起,是一種高效的篩選系統(tǒng)。在抗原表位的模擬、蛋白質(zhì)工程的改造、單鏈抗體的制備、藥物篩選及疫苗研制等方面,具有廣泛的用途。 基于以上分析,本研究擬應(yīng)用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)制備特異性抗人Endoglin單鏈抗體,并研究其生物學(xué)活性和體內(nèi)靶向腫瘤新生血管內(nèi)皮的作用,為探索早期卵巢癌診斷方法的研究奠定基礎(chǔ)。 研究目的:制備抗人Endoglin單鏈抗體,并檢測(cè)其生物學(xué)活性;初步探討抗人Endoglin單鏈抗體在荷人卵巢癌裸鼠體內(nèi)腫瘤放射免疫顯像中的應(yīng)用。 研究方法及結(jié)果:研究共分四部分。第一部分:以rhEndoglin(即重組人Endoglin胞外段)蛋白免疫Balb/c小鼠,純化免疫成功小鼠脾臟的mRNA,用RT-PCR方法擴(kuò)增出抗人Endoglin抗體的可變區(qū)基因,1%瓊脂糖凝膠電泳示,重鏈和輕鏈可變區(qū)基因大小分別為約340bp和約325bp,與預(yù)期相符;用重疊延伸PCR經(jīng)Linker序列把重鏈和輕鏈可變區(qū)基因連接成單鏈抗體基因,1%瓊脂糖凝膠電泳示,該基因大小約750bp,與預(yù)期相符,并用SfiⅠ和NotⅠ雙酶切該基因; 第二部分:把雙酶切的抗人Endoglin單鏈抗體基因克隆入經(jīng)同樣雙酶切的噬菌粒載體pCANTAB5E中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli TG1,再經(jīng)輔助噬菌體M13KO7感染,成功構(gòu)建抗人Endoglin單鏈抗體噬菌體呈現(xiàn)文庫(kù),庫(kù)容量約為3.98×106;用rhEndoglin抗原對(duì)文庫(kù)進(jìn)行5輪吸附-洗脫-富集panning淘篩,繼之用噬菌體ELISA篩選鑒定具有抗原結(jié)合能力的陽(yáng)性重組噬菌體克隆,結(jié)果一次性從隨機(jī)挑選的94個(gè)重組噬菌體克隆中篩選到37個(gè)陽(yáng)性克隆,陽(yáng)性克隆檢出率約為39.36%;據(jù)噬菌體ELISA結(jié)果,對(duì)抗原親和力最強(qiáng)的重組噬菌體克隆測(cè)序,獲得單鏈抗體基因序列;經(jīng)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),該基因全長(zhǎng)為738bp,共編碼246個(gè)氨基酸殘基。其中重鏈可變區(qū)基因編碼122個(gè)氨基酸殘基,位于單鏈抗體的N端,輕鏈可變區(qū)基因編碼109個(gè)氨基酸殘基,位于單鏈抗體的C端。兩個(gè)可變區(qū)之間通過(guò)(Gly4Ser)3組成的15肽連接。經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢,未發(fā)現(xiàn)任何與該單鏈抗體基因相同的序列;用ANTHEPROT V5.0軟件對(duì)單鏈抗體蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析,計(jì)算出目的蛋白的分子量為25925.818 Da。在重鏈和輕鏈可變區(qū)各有2個(gè)半胱氨酸,可形成2個(gè)二硫鍵。預(yù)測(cè)其等電點(diǎn)pI=9.015。并在生物醫(yī)學(xué)網(wǎng)站,自動(dòng)建模獲得該基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)模型; 第三部分:把第二部分測(cè)序正確的重組噬菌體感染大腸桿菌E.coli HB2151,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),成功表達(dá)了可溶性單鏈抗體蛋白,用SDS-PAGE和Western Blot鑒定分析,蛋白分子量約為29×103,集中在大腸桿菌的周質(zhì)和培養(yǎng)上清中,且周質(zhì)中蛋白表達(dá)量最高。確定最佳培養(yǎng)條件為:溫度30℃,振搖速度250rpm,IPTG濃度1mmol/L,誘導(dǎo)培養(yǎng)5h;用HiTrap Anti-E Tag Column親和層析純化經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)5h的細(xì)菌周質(zhì)提取物中的單鏈抗體,用HiTrap Desalting Column更換單鏈抗體的緩沖液為中性磷酸鹽緩沖液,SDS-PAGE鑒定純化抗體的純度大于95%;用PEG 8000濃縮純化的單鏈抗體,之后Bradford法測(cè)抗體濃度為1.12mg/ml;用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)單鏈抗體相對(duì)于抗rhEndoglin單抗的抗原結(jié)合活活性,結(jié)果表明,該單鏈抗體能與抗rhEndoglin單抗競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合rhEndoglin抗原表位,且競(jìng)爭(zhēng)作用隨單鏈抗體濃度增加而增強(qiáng);用間接ELISA測(cè)定單鏈抗體的功能性親和常數(shù)為(2.14±0.84)×107M-1;間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明,該單鏈抗體能檢測(cè)到HUVEC胞膜上表達(dá)的Endoglin,激光共聚焦顯微鏡下表現(xiàn)為胞膜上散在分布的綠色熒光點(diǎn); 第四部分:用瘤細(xì)胞懸液皮下注射法接種SKOV3人卵巢癌細(xì)胞于裸鼠皮下,經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí),成功建立了荷人卵巢癌裸鼠動(dòng)物模型;石蠟切片的免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn),單鏈抗體能使移植卵巢癌的血管內(nèi)皮胞膜呈陽(yáng)性著色,表明該單鏈抗體與移植卵巢癌中鼠源性血管內(nèi)皮有交叉反應(yīng);用預(yù)亞錫直接標(biāo)記法完成單鏈抗體的99mTc標(biāo)記,用紙層析法測(cè)定標(biāo)記率為83%;從鼠尾靜脈將99mTc標(biāo)單鏈抗體注入荷瘤鼠體內(nèi),Spect儀器觀察,對(duì)照組的腫瘤部位始終未顯像,而實(shí)驗(yàn)組中,在注藥后1h即可見(jiàn)腫瘤部位顯像,注藥后3h腫瘤顯像最清晰;γ放射免疫計(jì)數(shù)器檢測(cè)各組織的放射性計(jì)數(shù),計(jì)算腫瘤組織放射性計(jì)數(shù)/非腫瘤組織放射性計(jì)數(shù)的比值,該比值反應(yīng)了抗人Endoglin單鏈抗體在荷瘤鼠體內(nèi)的分布特點(diǎn),最高為2.96±1.71。 結(jié)論:利用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)成功制備了抗人Endoglin單鏈抗體;體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)該單鏈抗體具有較強(qiáng)的抗原結(jié)合能力;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),通過(guò)該單鏈抗體靶向腫瘤新生血管內(nèi)皮的作用,實(shí)現(xiàn)了荷瘤鼠體內(nèi)移植卵巢癌的放射免疫顯像。所以我們認(rèn)為,該單鏈抗體有望作為靶向卵巢癌新生血管內(nèi)皮的導(dǎo)向載體,為卵巢癌早期診斷方法的研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Endoglin is also a marker of transforming growth factor - 尾 ( TGF - 尾 ) receptor complex .



Increasing the rate of early ovarian cancer is the key to reduce the high mortality rate in ovarian cancer patients , but there is no ideal method for screening or / or early diagnosis of ovarian cancer . Therefore , it is particularly urgent and important to establish a specific early ovarian cancer diagnosis method . Ovarian cancer is a highly vascular malignancy , so it is possible to play an important role in the diagnosis and treatment of ovarian cancer .



The monoclonal antibody has the advantages of small molecular weight , strong penetrating power , no specific binding to Fc receptor of normal tissue , and complicated preparation process .



The invention relates to a phage surface rendering technology , which is a technique for expressing foreign genes by utilizing a phage . The phage display screen is used as a carrier , the target gene fragment is directionally inserted into a phage coat protein gene region , and the exogenous polypeptide or antibody is expressed and displayed on a phage surface , and then a DNA sequence determination is carried out .



Based on the above analysis , the specific anti - human Endoglin single chain antibody is prepared by the phage surface rendering technique , and the biological activity and the role of the in vivo targeting tumor neovascular endothelium are studied , which lays a foundation for the exploration of early ovarian cancer diagnosis methods .



Objective : To prepare the anti - human Endoglin single chain antibody and to detect the biological activity of human ovarian carcinoma nude mice .



In the first part , Balb / c mice were immunized with rhEndoglin ( i.e . recombinant human Endoglin extracellular domain ) protein . The variable region gene of anti - human Endoglin antibody was purified by RT - PCR .



In the second part , the human Endoglin single - chain antibody gene was cloned into the phage vector pCAND5E , which was digested by the same double enzyme , transformed into E . coli TG1 , then infected with the helper phage M13KO7 .



coli HB2151 was infected with E . coli HB2151 . After IPTG induction , the soluble single chain antibody was successfully expressed . The molecular weight of purified antibody was determined by SDS - PAGE and Western Blot . The purity of the purified antibody was higher than 95 % .



In the fourth part , the nude mouse model of human ovarian cancer was successfully established by subcutaneous injection with tumor cell suspension . The results showed that single chain antibody could be used to make positive staining of vascular endothelial cell membrane of ovarian cancer .



Conclusion : The anti - human Endoglin single chain antibody has been successfully prepared by using phage surface presentation technique . In vitro experiments have shown that the single chain antibody has stronger antigen binding ability . In vivo experiments have shown that the single chain antibody can be used to target tumor neovascularization . Therefore , it is believed that the single chain antibody is expected to be used as a guide vector for targeting ovarian cancer neovascular endothelium , which lays a foundation for the early diagnosis of ovarian cancer .

【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392;R737.31

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1773676