本文選題：多潛能干細胞 + 轉(zhuǎn)錄因子��； 參考：《西北農(nóng)林科技大學》2010年博士論文

【摘要】：誘導性多潛能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs )的研究尚處于初級階段,仍存在許多技術(shù)問題,其中之一是細胞重編程效率太低。目前,很多提高體細胞重編程效率的方法都集中在細胞誘導之后的細胞重編程過程,或是不同的誘導方法,而對提高兩個或多個病毒共感染細胞的效率方面尚未進行過系統(tǒng)全面的研究報道。 本研究首先用高濃度聚凝胺濃縮病毒結(jié)合低速離心的方法感染與狨猴同源性相近的人成纖維細胞(PHF),優(yōu)化逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞的方案,并且應(yīng)用小鼠(3T3)成纖維細胞進一步檢測優(yōu)化的感染細胞方法的可行性;其次,用優(yōu)化的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞的方法將4種轉(zhuǎn)錄因子(hOct4,hSox2,hKlf4和hc-Myc)基因?qū)胄律鹾锲つw成纖維細胞,首次將其誘導成為miPSCs;同時建立了miPSCs的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系,并且通過培養(yǎng)液中添加Rho-激酶抑制劑Y27632來促進miPSCs的單細胞的存活和增殖。 1、分別以人成纖維細胞和3T3細胞為靶細胞,雙嗜性包裝細胞系Plat-A生產(chǎn)的表達綠色熒光蛋白pLEGFP-N1和表達紅色熒光蛋白pMXs-dsRed2基因病毒按體積比為1:1(相同病毒滴度混合)的比例混合,比較未濃縮病毒的普通方法,優(yōu)化的離心感染細胞的方法(spinoculation),超速離心濃縮病毒(10,000 g),高濃度聚凝胺(Polybrene)濃縮病毒( Flocculation )以及濃縮病毒結(jié)合離心感染細胞的方法(spinoculation/Flocculation)對共轉(zhuǎn)染效率的影響,結(jié)果表明320μg/ml高濃度聚凝胺濃縮病毒(Flocculation)同低速離心感染細胞(spinoculation)相結(jié)合的方法將共轉(zhuǎn)染率由普通方法的4.0±0.1%(PHF)和3.4±0.2%(3T3)分別提高到了53.0±0.6%(PHF)和35.0±0.4%(3T3)。 2、用優(yōu)化的逆轉(zhuǎn)錄病毒共轉(zhuǎn)染的方法將逆轉(zhuǎn)錄病毒pMXs-hOct4,hSox2,hKlf4,hc-Myc 4種轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)胄律鹾锲つw成纖維細胞(MF),用1mM丙戊酸的培養(yǎng)液處理12天。感染4×10~5 MF,獲得大約100個iPSCs樣克隆,克隆分離培養(yǎng)于MEF飼養(yǎng)層上。其中30個克隆能夠擴大培養(yǎng),并冷凍保存。從中挑選8個克隆作為進一步的生物學特性研究,具有典型胚胎干細胞的形態(tài)特征,堿性磷酸酶染色呈陽性;qPCR結(jié)果表明表達很高的Nanog,Oct4和Sox2 mRNAs而相應(yīng)的載體基因保持沉默;具有正常的染色體核型;免疫細胞化學表明表達胚胎干細胞特異性標志Oct4以及階段特異性胚胎表面抗原SSEA-4,腫瘤排斥抗原TRA-1-81;于嚴重聯(lián)合性免疫缺陷小鼠(RAG2-/-,c-/-)體內(nèi)形成具有內(nèi)、中、外三個胚層不同組織結(jié)構(gòu)的畸胎瘤。因此,所得miPSCs是完全重編程細胞。 3、以MEF,STO分別制備條件培養(yǎng)液,比較了不同條件培養(yǎng)液對miPSCs的影響;同時,本試驗以MEF為條件培養(yǎng)液比較了不同濃度血清(FBS)(10 %,15 %和20 %),不同濃度的條件培養(yǎng)液(35 %和17.5 %)以及不同濃度bFGF(20 ng/ml,100 ng/ml和150 ng/ml)對miPSCs的影響。通過qPCR的方法研究Oct4,Sox2,nanog表達的影響,于不同濃度FBS、條件培養(yǎng)液和bFGF中基因表達水平?jīng)]有差異,并且同MEF為飼養(yǎng)層培養(yǎng)的miPSCs的基因表達水平?jīng)]有差異;無飼養(yǎng)層條件下miPSCs堿性磷酸酶呈陽性;免疫細胞化學表明表達胚胎干細胞特異性標志Oct4以及表面抗原TRA-1-81和SSEA-3,SSEA-4;具有正常的核型;體外能夠分化為神經(jīng)元,嚴重聯(lián)合性免疫缺陷小鼠(RAG2-/-,c-/-)體內(nèi)形成具有三個胚層不同組織結(jié)構(gòu)的畸胎瘤,說明無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系適用于miPSCs。 4、用Accutase將miPSCs消化為單個細胞,通過將無飼養(yǎng)層培養(yǎng)液中添加10μmol/L Y27632,培養(yǎng)低密度miPSCs檢驗Y27632的影響,結(jié)果表明Y27632能夠促進miPSCs存活,其克隆效率由5.0±0.4 %提高到33.0±6.7 % (P0.01);提高冷凍復蘇細胞的克隆效率到36.0±6.7 %(P0.01);BrdU免疫熒光染色表明,Y27632能夠促進miPSCs的增殖,BrdU陽性細胞數(shù)由27.0±2.1 %提高到了34.0±1.8 %(P0.01);qPCR、免疫細胞化學表明,仍表達Nanog,Oct4和Sox2;具有正常的核型;能夠體外分化為神經(jīng)元,嚴重聯(lián)合性免疫缺陷小鼠體內(nèi)形成具有三個胚層組織的畸胎瘤,因此,10μmol/L Y27632培養(yǎng)條件下的miPSCs仍具有多能性。
[Abstract]:Induced pluripotent stem cells (induced pluripotent stem cells, iPSCs) the research is still in the initial stage, there are still many technical problems, one of which is the cell reprogramming efficiency is too low. At present, many cell reprogramming of somatic cell reprogramming improve the efficiency of the method are concentrated in cells after induced, or induced different methods, and to improve the two or more virus co infection efficiency of cells has not yet been systematic research reports comprehensively.
In this study, with a high concentration of Polybrene concentrated virus combined with low speed centrifugal method infection and marmoset homologous Their natures are much the same. human fibroblast (PHF) cells, optimization of retroviral infection, and application of mice (3T3) infected cells and fibroblasts feasibility method further optimized detection; secondly, using the method of optimization retrovirus infected cells will be 4 transcription factors (hOct4, hSox2, hKlf4 and hc-Myc) gene into neonatal marmoset skin fibroblasts, the first to be induced miPSCs; while establishing a feeder free culture system of miPSCs, and through the medium adding Rho- kinase inhibitor Y27632 to promote miPSCs single cell survival and proliferation.
1, with human fibroblasts and 3T3 cells as target cells, eosinophils double expression of green fluorescent protein pLEGFP-N1 packaging cell line Plat-A production and expression of red fluorescent protein gene of pMXs-dsRed2 virus according to the volume ratio of 1:1 (the same virus titer mixed) mixture was compared with common methods for virus concentration, optimization of centrifugal method the infected cells (spinoculation), ultracentrifugation virus concentration (10000 g), high concentration of Polybrene (Polybrene) virus concentration (Flocculation) method of centrifugal infected cells and concentrated virus binding (spinoculation/Flocculation) effect on CO transfection efficiency. The results show that 320 g/ml high concentration of Polybrene (Flocculation) with concentrated virus low speed centrifugation of infected cells (spinoculation) method combining co transfection rate by way of 4 + 0.1% and 3.4 + 0.2% (PHF) (3T3) were increased to 53 + 0.6% (PHF) and 35 + 0.4% (3T3).
2, using the method of optimization of retroviral co transfected with the retroviral pMXs-hOct4, hSox2, hKlf4, hc-Myc 4 transcription factor gene into neonatal marmoset skin fibroblasts (MF), 1mM valproic acid culture medium for 12 days. The infection of 4 * 10~5 MF, about 100 iPSCs like cloning, cloning cultured on MEF feeder layer. Among the 30 clones can expand cultivation and cryopreservation. 8 clones from the biological characteristics as the research further, with the morphological characteristics of embryonic stem cells, alkaline phosphatase staining was positive; qPCR showed high expression of Nanog, Oct4 and Sox2 mRNAs and the corresponding gene carrier keep silent; with normal karyotype; Immunocytochemistry showed that the expression of embryonic stem cell specific markers Oct4 and stage specific embryonic antigen SSEA-4, tumor rejection antigen TRA-1-81 in severe combined; In RAG2-/- (c-/-), there are three teratoma with inner, outer and outer miPSCs.
In 3, MEF, STO were prepared by conditioned medium, different conditioned medium effect on miPSCs; at the same time, the experiment with MEF conditioned medium compared with the different concentration of serum (FBS) (10%, 15% and 20%), different concentrations of conditioned medium (35% and 17.5%) and different the concentration of bFGF (20 ng/ml, 100 ng/ml and 150 ng/ml) effect on miPSCs. Through the study of Oct4, qPCR Sox2, expression of Nanog, FBS in different concentration, culture conditions did not differ between the gene expression level of liquid and bFGF, and with MEF as feeder layer culture of miPSCs gene expression level was no difference; without feeder layer miPSCs under the condition of alkaline phosphatase was positive; Immunocytochemistry showed that the expression of embryonic stem cell specific markers Oct4 and surface antigen TRA-1-81 and SSEA-3, SSEA-4; with normal karyotype; in vitro can differentiate into neurons, severe combined immunodeficiency mice (R AG2-/-, c-/-) formation of teratoma with three different tissue structures in the body, indicating that no feeder culture system is suitable for miPSCs.
4, Accutase miPSCs will be digested into single cells, the feeder free medium with 10 mol/L Y27632 training, training effect of low density miPSCs Y27632 test, the results show that Y27632 can promote miPSCs survival, the cloning efficiency is increased from 5 + 0.4% to 33 + 6.7% (P0.01); to improve the efficiency of cloning of cryopreserved cells to 36 + 6.7% (P0.01); BrdU immunofluorescence staining showed that Y27632 can promote the proliferation of miPSCs, the number of BrdU positive cells from 27 + 2.1% to 34 + 1.8% (P0.01); qPCR, immunocytochemistry showed that the expression of Oct4 and Sox2 is Nanog; with normal karyotype can differentiate into in vitro; the formation of neurons, severe combined immunodeficient mice with three germ layers of teratoma, therefore, 10 mol/L Y27632 culture condition miPSCs still have pluripotency.

【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R329

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本文編號：1764004