本文選題：肺炎鏈球菌 + comE�。� 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】： 轉(zhuǎn)化是細(xì)菌基因重組最常見的方式之一,轉(zhuǎn)化的結(jié)果可使細(xì)菌的染色體整合上外源DNA,從而使其某些生物學(xué)特征發(fā)生變化,并能代代遺傳。大量研究證明細(xì)菌的轉(zhuǎn)化與其進(jìn)化、毒力因子和耐藥性等生物學(xué)性狀的表達(dá)密切相關(guān)。同時(shí)轉(zhuǎn)化也成為實(shí)驗(yàn)室對(duì)細(xì)菌進(jìn)行基因改造的一個(gè)簡(jiǎn)便而重要工具。 肺炎鏈球菌可以在自然生長(zhǎng)狀態(tài)下產(chǎn)生感受態(tài)而發(fā)生轉(zhuǎn)化,即自然轉(zhuǎn)化;其感受態(tài)也可通過感受態(tài)刺激因子(competence-stimulating peptide,CSP)誘導(dǎo)產(chǎn)生,即誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化。目前調(diào)控肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化的基本分子網(wǎng)絡(luò)已清楚,但肺炎鏈球菌在不同生長(zhǎng)階段、不同濃度CSP誘導(dǎo)時(shí)的轉(zhuǎn)化率差別很大,其分子機(jī)制尚不清楚。操縱子comCDE是調(diào)控肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化發(fā)生的關(guān)鍵基因,其中comE為該操縱子發(fā)揮作用的效應(yīng)蛋白,細(xì)菌不同轉(zhuǎn)化率的發(fā)生是否就是該基因表達(dá)變化的直接結(jié)果呢?我們的研究思路是:首先缺陷基因comE,以驗(yàn)證基因comE在細(xì)菌轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵作用,然后分別探討CSP誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化和自然轉(zhuǎn)化中不同轉(zhuǎn)化率的發(fā)生與該基因的相關(guān)性,并通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法初步探索其調(diào)控機(jī)制。本研究包括以下三個(gè)部分: 1. comE基因?qū)Ψ窝祖溓蚓D(zhuǎn)化的影響。構(gòu)建comE基因缺陷菌株,比較野生菌株和缺陷菌株的自然轉(zhuǎn)化率及CSP誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化率,結(jié)果顯示comE基因缺陷菌株的自然轉(zhuǎn)化率和CSP誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化率為0,提示基因comE為細(xì)菌自然轉(zhuǎn)化和CSP誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化所必需。 2.探討肺炎鏈球菌在不同生長(zhǎng)時(shí)間的自然轉(zhuǎn)化率與comE基因表達(dá)變化的相關(guān)性。通過熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)comE基因在細(xì)菌不同時(shí)期的mRNA表達(dá)水平,并測(cè)定對(duì)應(yīng)的細(xì)菌轉(zhuǎn)化率。結(jié)果顯示細(xì)菌在整個(gè)生長(zhǎng)過程中只有一個(gè)轉(zhuǎn)化率高峰,約在菌密度為A550=0.3左右;而基因comE的mRNA表達(dá)則有2~3個(gè)高峰期,與細(xì)菌不同轉(zhuǎn)化率的發(fā)生無顯著相關(guān)性(r0.3),提示可能存在基因comE以外的其他因子與細(xì)菌的自然轉(zhuǎn)化率直接相關(guān)。 3.探討不同濃度CSP誘導(dǎo)細(xì)菌發(fā)生的不同轉(zhuǎn)化率與comE基因表達(dá)變化的相關(guān)性。通過熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)comE基因在不同濃度CSP誘導(dǎo)時(shí)、不同時(shí)期的mRNA表達(dá)水平,并測(cè)定對(duì)應(yīng)的細(xì)菌轉(zhuǎn)化率。結(jié)果顯示(1)comE的mRNA表達(dá)水平在100μg/L CSP誘導(dǎo)后10min顯著上升,之后迅速下降,其轉(zhuǎn)化率與其comE的基礎(chǔ)表達(dá)顯著相關(guān)(r0.99),提示在該CSP濃度下,細(xì)菌的不同轉(zhuǎn)化率發(fā)生與comE的基礎(chǔ)表達(dá)量相關(guān)。(2)10μg/L、100μg/L和1000μg/L的CSP誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化時(shí),細(xì)菌的轉(zhuǎn)化率沒有隨其濃度的增加而升高,comE只在100μg/L的CSP誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)量增加,表明細(xì)菌不同轉(zhuǎn)化率發(fā)生及comE的誘導(dǎo)表達(dá)量變化與CSP不存在明顯濃度依賴性,提示存在CSP以外的其他因子調(diào)控基因comE的表達(dá)及細(xì)菌的轉(zhuǎn)化,且可能存在基因comE以外的其他因子與細(xì)菌的轉(zhuǎn)化率直接相關(guān)。 為了探尋細(xì)菌轉(zhuǎn)化可能的調(diào)控機(jī)制,我們應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)(雙向電泳結(jié)合MALDI-TOF-MS)對(duì)肺炎鏈球菌感受態(tài)發(fā)生到關(guān)閉這一時(shí)間段內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行比較,從蛋白水平分析了其發(fā)生不同轉(zhuǎn)化率的分子機(jī)制。結(jié)果顯示細(xì)菌在發(fā)生不同轉(zhuǎn)化率時(shí)期的蛋白表達(dá)譜有一定差異,具體差異尚需進(jìn)一步研究。
[Abstract]:Transformation is one of the most common ways of bacterial gene recombination , and the results of transformation can make the chromosome of bacteria integrate exogenous DNA , so that some biological characteristics of bacteria can be changed , and the inheritance can be replaced . A large number of researches show that the transformation of bacteria is closely related to the expression of biological characters such as evolution , virulence factors and drug resistance .


The transformation of Streptococcus pneumoniae can be induced by inductive stimulation ( CSP ) , which is the key gene for regulating the transformation of S . pneumoniae . The research thought is : firstly , the gene comE is the key gene for regulating the transformation of Streptococcus pneumoniae .


1 . The effect of comE gene on the transformation of Streptococcus pneumoniae was constructed . The natural conversion and CSP induced transformation rate of comE gene were compared . The results showed that the natural transformation rate and CSP induced transformation rate of comE gene deficient strains were 0 , suggesting that comE was necessary for bacterial natural transformation and CSP induced transformation .


2 . To investigate the correlation between the natural conversion of Streptococcus pneumoniae at different growth times and the expression of comE gene . The mRNA expression level of comE gene in different periods of bacteria was determined by fluorescence quantitative PCR . The results showed that there was only one peak of transformation in the whole growth process , and there was no significant correlation between the expression of gene comE and the transformation rate of bacteria ( r0.3 ) . It was suggested that there might be a direct correlation between the other factors besides comE and the natural conversion rate of bacteria .


3 . The expression level of comE mRNA in different concentrations of CSP was determined by fluorescence quantitative PCR . The results showed that the expression level of comE increased significantly after 10 min after induction of 100 渭g / L CSP . The results showed that the expression of comE and comE increased rapidly after the induction of 100 渭g / L CSP .


In order to explore the possible regulatory mechanism of bacterial transformation , we compared the proteins expressed during the period of closing this time period by using the proteomic technique ( two - dimensional electrophoresis combined with MALDI - TOF - MS ) . The molecular mechanism of different conversion rate was analyzed from the protein level . The results showed that the protein expression profiles of the bacteria in different transformation periods were different , and the specific differences still needed further study .

【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R378.14

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本文編號(hào)：1763491