本文選題：鼠疫菌 + 反向疫苗學(xué)��； 參考：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2008年博士論文

【摘要】： 背景鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)(簡(jiǎn)稱鼠疫菌)引起的一種甲類傳染病,多重耐藥菌株的產(chǎn)生以及鼠疫菌可以用做生物武器的可能給鼠疫的預(yù)防、治療帶來(lái)了困難。有效的疫苗接種能阻斷鼠疫的傳播,達(dá)到最終消滅鼠疫的目的。但是,迄今為止,還沒(méi)有一種能夠在大范圍內(nèi)使用并且切實(shí)有效的鼠疫疫苗。滅活及減毒活疫苗在20世紀(jì)亞洲鼠疫流行地區(qū)中的應(yīng)用十分廣泛,免疫原性與反應(yīng)性的變異及短期的保護(hù)力意味著通過(guò)在整個(gè)疫區(qū)接種這類疫苗來(lái)防御鼠疫并不可行。鼠疫亞單位疫苗和DNA疫苗的研究主要集中在鼠疫菌已知的兩個(gè)主要保護(hù)性抗原F1(莢膜抗原)和LcrV(V抗原)上�；贔1和LcrV抗原基礎(chǔ)上的疫苗對(duì)腺型鼠疫具有理想的保護(hù)效果,但這類疫苗對(duì)肺型鼠疫的保護(hù)效果不甚理想。另外,鼠疫自然疫源地中存在的F1-菌株也能引起人類感染,而V抗原存在血清學(xué)變異。因此尋找其它的具有免疫保護(hù)作用的蛋白并將其與F1和LcrV抗原聯(lián)合免疫或制備多亞單位疫苗是鼠疫疫苗研究的一個(gè)方向。除體液免疫外,細(xì)胞免疫是鼠疫免疫的一個(gè)重要組成部分,同時(shí)能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫的疫苗將能更有效地預(yù)防鼠疫。目前,關(guān)于鼠疫菌感染后細(xì)胞免疫的研究還很少,最近的研究發(fā)現(xiàn),鼠疫菌在感染過(guò)程中產(chǎn)生的T細(xì)胞免疫不只是針對(duì)F1和LcrV抗原,還有其它蛋白在對(duì)鼠疫菌細(xì)胞免疫保護(hù)過(guò)程中起著作用。本課題的研究目的就是通過(guò)蛋白芯片和Elispot技術(shù)對(duì)鼠疫菌感染后機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)從而尋找在鼠疫菌感染過(guò)程中能夠刺激體液和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)的蛋白,并對(duì)部分篩選出來(lái)的蛋白進(jìn)行免疫保護(hù)性的初步評(píng)價(jià)。 方法通過(guò)PSORTb、SignalP和ProtcompB等生物信息學(xué)軟件對(duì)鼠疫菌CO92株基因組所有編碼蛋白的細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè),并利用TopPred軟件分析蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域,挑選出所有跨膜區(qū)少于4個(gè)的鼠疫菌的膜相關(guān)性蛋白或分泌性蛋白。結(jié)合現(xiàn)階段對(duì)鼠疫菌毒力、進(jìn)化、疫苗以及對(duì)其它微生物的疫苗等相關(guān)研究,挑選出所有鼠疫菌已知的、推測(cè)的毒力相關(guān)基因以及與在其它微生物的具有免疫保護(hù)性蛋白具有同源性的相關(guān)基因。利用Gateway重組克隆技術(shù)或限制性內(nèi)切酶酶切克隆技術(shù)將要表達(dá)的基因克隆至表達(dá)載體pDEST17或pET32a上并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá),在大腸桿菌中表達(dá)的目的蛋白通過(guò)Ni-NTA層析柱純化。利用Elispot試驗(yàn)檢測(cè)重組表達(dá)蛋白體外刺激鼠疫菌EV76減毒活疫苗株免疫小鼠的脾細(xì)胞中分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù),從而尋找能夠刺激明顯T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的鼠疫菌蛋白。同時(shí)利用所有體外重組表達(dá)的鼠疫菌蛋白所構(gòu)建的蛋白芯片,檢測(cè)感染鼠疫菌的貓、狗、人血清中抗鼠疫菌蛋白的抗體種類和反應(yīng)強(qiáng)度,并通過(guò)對(duì)不同溫度(26°C和37°C)培養(yǎng)條件下的鼠疫菌吸收后的患者血清抗體譜的分析尋找鼠疫菌可能的毒力相關(guān)或膜相關(guān)性蛋白。將部分挑選出的具有體液免疫和/或細(xì)胞免疫功能的蛋白免疫小鼠進(jìn)行蛋白免疫保護(hù)功能的檢測(cè),被初步證明具有免疫保護(hù)功能的蛋白將作為候選疫苗靶標(biāo)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。 結(jié)果通過(guò)生物信息學(xué)分析并結(jié)合目前對(duì)鼠疫菌的研究,共挑選出261個(gè)鼠疫菌基因作為篩選鼠疫菌疫苗亞單位的靶標(biāo)。利用Array Designer軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物,片段800bp的基因盡量表達(dá)全長(zhǎng),大于800bp的基因通過(guò)DNAStar軟件分析后表達(dá)預(yù)測(cè)抗原性較好的片段。通過(guò)Gateway重組克隆技術(shù)或限制性內(nèi)切酶酶切克隆技術(shù)將要表達(dá)的基因克隆至表達(dá)載體pDEST17或pET32a上,根據(jù)重組大腸桿菌克隆的SDS-PAGE電泳結(jié)果,有174個(gè)重組克隆能夠在大腸桿菌中表達(dá)相應(yīng)的鼠疫菌蛋白。由于所挑選基因編碼蛋白大多數(shù)為膜相關(guān)性蛋白,通過(guò)Ni-NTA純化和PBS透析后最終只有101個(gè)鼠疫菌重組蛋白的濃度與純度滿足進(jìn)行細(xì)胞免疫功能檢測(cè)的要求。利用Elispot試驗(yàn)檢測(cè)EV76疫苗株免疫小鼠后小鼠針對(duì)鼠疫菌的細(xì)胞免疫反應(yīng)情況,34個(gè)鼠疫菌蛋白體外能夠明顯的刺激EV76免疫小鼠的脾細(xì)胞分泌IFN-γ,這些蛋白被認(rèn)為能夠刺激T細(xì)胞免疫反應(yīng)。另一方面,構(gòu)建了包括218個(gè)鼠疫菌蛋白的蛋白芯片,通過(guò)對(duì)蛋白芯片與鼠疫菌感染的貓、狗和患者血清反應(yīng)的抗體譜的分析,發(fā)現(xiàn)了20個(gè)可能在鼠疫菌侵入機(jī)體后為適應(yīng)機(jī)體環(huán)境或者其它壓力條件而特異性合成的蛋白,這些蛋白可能與細(xì)菌在人體內(nèi)的毒力相關(guān)。結(jié)合體液免疫和細(xì)胞免疫的結(jié)果,初步對(duì)28個(gè)蛋白的免疫保護(hù)性進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果有9個(gè)蛋白能夠?qū)?0LD50鼠疫菌201株的攻擊產(chǎn)生部分保護(hù)力。 結(jié)論通過(guò)對(duì)鼠疫菌感染后機(jī)體體液免疫與細(xì)胞免疫反應(yīng)情況的分析,對(duì)28個(gè)能刺激體液和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)的蛋白的免疫保護(hù)性進(jìn)行了檢測(cè),初步證明了9個(gè)蛋白能夠?qū)Φ蛣┝渴笠呔?01株的攻擊提供部分保護(hù)力。通過(guò)本課題的研究建立了鼠疫菌反向疫苗學(xué)研究的技術(shù)路線,縮短了鼠疫菌疫苗研究的時(shí)間,為后續(xù)鼠疫菌疫苗研究提供了靶標(biāo)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392

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