本文選題：鼠疫菌 + 反向疫苗學��； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2008年博士論文

【摘要】： 背景鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)(簡稱鼠疫菌)引起的一種甲類傳染病,多重耐藥菌株的產(chǎn)生以及鼠疫菌可以用做生物武器的可能給鼠疫的預防、治療帶來了困難。有效的疫苗接種能阻斷鼠疫的傳播,達到最終消滅鼠疫的目的。但是,迄今為止,還沒有一種能夠在大范圍內(nèi)使用并且切實有效的鼠疫疫苗。滅活及減毒活疫苗在20世紀亞洲鼠疫流行地區(qū)中的應用十分廣泛,免疫原性與反應性的變異及短期的保護力意味著通過在整個疫區(qū)接種這類疫苗來防御鼠疫并不可行。鼠疫亞單位疫苗和DNA疫苗的研究主要集中在鼠疫菌已知的兩個主要保護性抗原F1(莢膜抗原)和LcrV(V抗原)上。基于F1和LcrV抗原基礎(chǔ)上的疫苗對腺型鼠疫具有理想的保護效果,但這類疫苗對肺型鼠疫的保護效果不甚理想。另外,鼠疫自然疫源地中存在的F1-菌株也能引起人類感染,而V抗原存在血清學變異。因此尋找其它的具有免疫保護作用的蛋白并將其與F1和LcrV抗原聯(lián)合免疫或制備多亞單位疫苗是鼠疫疫苗研究的一個方向。除體液免疫外,細胞免疫是鼠疫免疫的一個重要組成部分,同時能夠刺激機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫的疫苗將能更有效地預防鼠疫。目前,關(guān)于鼠疫菌感染后細胞免疫的研究還很少,最近的研究發(fā)現(xiàn),鼠疫菌在感染過程中產(chǎn)生的T細胞免疫不只是針對F1和LcrV抗原,還有其它蛋白在對鼠疫菌細胞免疫保護過程中起著作用。本課題的研究目的就是通過蛋白芯片和Elispot技術(shù)對鼠疫菌感染后機體體液免疫和細胞免疫反應進行檢測從而尋找在鼠疫菌感染過程中能夠刺激體液和/或細胞免疫反應的蛋白,并對部分篩選出來的蛋白進行免疫保護性的初步評價。 方法通過PSORTb、SignalP和ProtcompB等生物信息學軟件對鼠疫菌CO92株基因組所有編碼蛋白的細胞定位進行預測,并利用TopPred軟件分析蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域,挑選出所有跨膜區(qū)少于4個的鼠疫菌的膜相關(guān)性蛋白或分泌性蛋白。結(jié)合現(xiàn)階段對鼠疫菌毒力、進化、疫苗以及對其它微生物的疫苗等相關(guān)研究,挑選出所有鼠疫菌已知的、推測的毒力相關(guān)基因以及與在其它微生物的具有免疫保護性蛋白具有同源性的相關(guān)基因。利用Gateway重組克隆技術(shù)或限制性內(nèi)切酶酶切克隆技術(shù)將要表達的基因克隆至表達載體pDEST17或pET32a上并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達,在大腸桿菌中表達的目的蛋白通過Ni-NTA層析柱純化。利用Elispot試驗檢測重組表達蛋白體外刺激鼠疫菌EV76減毒活疫苗株免疫小鼠的脾細胞中分泌IFN-γ的細胞數(shù),從而尋找能夠刺激明顯T淋巴細胞反應的鼠疫菌蛋白。同時利用所有體外重組表達的鼠疫菌蛋白所構(gòu)建的蛋白芯片,檢測感染鼠疫菌的貓、狗、人血清中抗鼠疫菌蛋白的抗體種類和反應強度,并通過對不同溫度(26°C和37°C)培養(yǎng)條件下的鼠疫菌吸收后的患者血清抗體譜的分析尋找鼠疫菌可能的毒力相關(guān)或膜相關(guān)性蛋白。將部分挑選出的具有體液免疫和/或細胞免疫功能的蛋白免疫小鼠進行蛋白免疫保護功能的檢測,被初步證明具有免疫保護功能的蛋白將作為候選疫苗靶標進行進一步的研究。 結(jié)果通過生物信息學分析并結(jié)合目前對鼠疫菌的研究,共挑選出261個鼠疫菌基因作為篩選鼠疫菌疫苗亞單位的靶標。利用Array Designer軟件設(shè)計相應的引物,片段800bp的基因盡量表達全長,大于800bp的基因通過DNAStar軟件分析后表達預測抗原性較好的片段。通過Gateway重組克隆技術(shù)或限制性內(nèi)切酶酶切克隆技術(shù)將要表達的基因克隆至表達載體pDEST17或pET32a上,根據(jù)重組大腸桿菌克隆的SDS-PAGE電泳結(jié)果,有174個重組克隆能夠在大腸桿菌中表達相應的鼠疫菌蛋白。由于所挑選基因編碼蛋白大多數(shù)為膜相關(guān)性蛋白,通過Ni-NTA純化和PBS透析后最終只有101個鼠疫菌重組蛋白的濃度與純度滿足進行細胞免疫功能檢測的要求。利用Elispot試驗檢測EV76疫苗株免疫小鼠后小鼠針對鼠疫菌的細胞免疫反應情況,34個鼠疫菌蛋白體外能夠明顯的刺激EV76免疫小鼠的脾細胞分泌IFN-γ,這些蛋白被認為能夠刺激T細胞免疫反應。另一方面,構(gòu)建了包括218個鼠疫菌蛋白的蛋白芯片,通過對蛋白芯片與鼠疫菌感染的貓、狗和患者血清反應的抗體譜的分析,發(fā)現(xiàn)了20個可能在鼠疫菌侵入機體后為適應機體環(huán)境或者其它壓力條件而特異性合成的蛋白,這些蛋白可能與細菌在人體內(nèi)的毒力相關(guān)。結(jié)合體液免疫和細胞免疫的結(jié)果,初步對28個蛋白的免疫保護性進行檢測,結(jié)果有9個蛋白能夠?qū)?0LD50鼠疫菌201株的攻擊產(chǎn)生部分保護力。 結(jié)論通過對鼠疫菌感染后機體體液免疫與細胞免疫反應情況的分析,對28個能刺激體液和/或細胞免疫反應的蛋白的免疫保護性進行了檢測,初步證明了9個蛋白能夠?qū)Φ蛣┝渴笠呔?01株的攻擊提供部分保護力。通過本課題的研究建立了鼠疫菌反向疫苗學研究的技術(shù)路線,縮短了鼠疫菌疫苗研究的時間,為后續(xù)鼠疫菌疫苗研究提供了靶標。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392

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