本文選題：胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞 + CD34~+細(xì)胞��； 參考：《鄭州大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】：研究背景及目的 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenehymal stem cell,MSC)是目前倍受關(guān)注的一類具有多向分化潛能的組織干細(xì)胞。Fridenestein等于1976年最早利用骨髓貼壁層細(xì)胞培養(yǎng)形成了成纖維細(xì)胞和其它間質(zhì)細(xì)胞。隨后其他學(xué)者也描述了來源于骨髓的非造血性貼壁細(xì)胞,可以分化為成熟的間質(zhì)細(xì)胞。認(rèn)為這種原始細(xì)胞可形成骨髓和外膜間質(zhì)細(xì)胞,構(gòu)成造血的微環(huán)境,形成結(jié)締組織骨架并產(chǎn)生細(xì)胞因子、化學(xué)因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白來調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的歸巢和增殖。體外培養(yǎng)MSC分泌多種造血因子,并能表達(dá)多種表面粘附分子,在造血調(diào)控中具有一定的作用。因此,移植MSC使其恢復(fù)骨髓微環(huán)境,支持自體和同種異基因造血干細(xì)胞移植和重建,引起了很多研究者的關(guān)注。 造血干/祖細(xì)胞(hematopoietie Stem/progenitor Cell,HSPC)的擴增和增殖,造血因子是必不可少的。Hyanesworht等培養(yǎng)了可向成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞分化的原始間充質(zhì)細(xì)胞,單克隆抗體檢測其表達(dá)SH-2、SH-3和SH-4。在無造血細(xì)胞和分化刺激存在的培養(yǎng)條件下,可產(chǎn)生多種造血相關(guān)因子,包括干細(xì)胞因子(CSF)、白血病抑制因子(LIF)、巨嗜系集落刺激因子(M-CSF)、粒系集落刺激因子(G-CFS)、白細(xì)胞介素IL-6和IL-11。而粒單系集落刺激因子(MG-CSF)、IL-3、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β2)未被檢測到。用具有能增強骨髓基質(zhì)細(xì)胞支持造血能力的因子IL-Ia,刺激這種原始間充質(zhì)細(xì)胞,可提高其G-CFS、M-CFS、LIF、IL-6和LI-11的產(chǎn)生水平,而且工IL-Ia還能誘導(dǎo)其產(chǎn)生GM-CSF。Majumdar等比較了骨髓來源的MCS和傳統(tǒng)基質(zhì)細(xì)胞,通過RT-PRC檢測了造血相關(guān)因子mRNA的表達(dá),結(jié)果表明MSC穩(wěn)定的表達(dá)多種造血相關(guān)因子IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、-12、IL-14、IL-15、M-CSF、SCF和Flt-3配體(FL),且IL-11、IL-12的表達(dá)水平明顯高于基質(zhì)細(xì)胞。兩種細(xì)胞在IL-Ia誘導(dǎo)下均表達(dá)G-CFS和GM-CFS,但LIF和IL-Ia的mRNA則只在MSC中被誘導(dǎo)表達(dá)。 目前對造血干細(xì)胞CD34~+的體外擴增主要靠加入不同組合的細(xì)胞因子,體外加入的細(xì)胞因子很難模擬造血的微環(huán)境,且在培養(yǎng)過程中需要不斷加入,價格昂貴,不適合長期培養(yǎng)。近來有研究者用骨髓基質(zhì)支持骨髓來源的CD34~+細(xì)胞,用胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞支持臍血來源的CD34~+細(xì)胞,也取得很好的效果,胎盤作為胎兒的附屬物,在胎兒娩出后往往作為廢棄物被處理,近年有研究者發(fā)現(xiàn)胎盤組織及胎盤血中存在造血干細(xì)胞,及間充質(zhì)干細(xì)胞,并且研究證實胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞可分泌多種造血相關(guān)因子。因此我們從胎盤中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞,作為不同來源的CD34~+的滋養(yǎng)層,觀察其對不同來源造血干細(xì)胞的支持?jǐn)U增作用的差別。 材料: 胎盤及臍血樣品:正常健康新鮮的胎盤組織和臍血來自鄭大一附院婦產(chǎn)科。骨髓樣品正常新鮮的骨髓來自鄭大一附院兒科磁性細(xì)胞分選儀及CD34~+細(xì)胞分離盒為Miltenyi Biotec公司產(chǎn)品。 細(xì)胞因子和抗體:B-fbf為Gibco公司產(chǎn)品�？笴D29、CD19、CD34、CD44、CD45、HLA-DR、HLA-ABC、CD105、CD106及UEA-Ⅰ單克隆抗體為PharMingen公司 主要試劑:牛血清白蛋白BSA甲基纖維素、巰基乙醇、谷氨酰胺、氫化考的松、膠原酶Ⅳ、透明質(zhì)酸酶、DNaseⅠ酶均購自Sigma公司。DMEM培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基,四季青胎牛血清均為Hyclone公司產(chǎn)品。 方法 1.胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定:將膠原酶消化后的胎盤組織細(xì)胞用100目的不銹鋼網(wǎng)濾過,去除未消化組織,濾過后的懸液用無菌PBS液洗兩遍,按5×10~6個/ml接種含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基中,在37℃恒溫箱,5%CO_2和飽和濕度下培養(yǎng)。貼壁48-72小時后去除未貼壁細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng),3-4天換液一次。待細(xì)胞80-90%融合后,用胰蛋白酶(0.25%)消化,傳代培養(yǎng)。 2.將傳代3代以上的細(xì)胞用免疫組化方法確定其外形特點。分別取第6、9和12代細(xì)胞,用0.25%的胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞,PBS洗滌計數(shù)后,分別與抗CD19,CD29,CD34,CD44,CD45,CD105,CD106,HLA-DR,HLA-ABC,UEA-1單克隆抗體室溫避光反應(yīng)30分鐘。PBS液沖洗后,用流式細(xì)胞儀檢測其表面標(biāo)志。 3.不同來源血干細(xì)胞CD34~+的提取:常規(guī)提取骨髓臍血及胎盤組織的單個核細(xì)胞,用免疫磁珠法分離出CD34~+細(xì)胞。 4.造血干細(xì)胞細(xì)胞擴增分組:試驗分為A:無滋養(yǎng)層組B:有滋養(yǎng)層組。A組分為A1(骨髓組)A2組(臍血組)A3(胎盤組);B組分為B1組(骨髓組)B2(臍血組)B3組(胎盤組)每組6復(fù)孔。將不同來源的造血干細(xì)胞分別置于上述培養(yǎng)基中,每周進行有核細(xì)胞計數(shù),CD34~+細(xì)胞比例流式檢測,計算CD34~+細(xì)胞的擴增倍數(shù)。 5.統(tǒng)計學(xué)處理計數(shù)資料采用重復(fù)測量的方差分析,判定結(jié)果的差異性 結(jié)果 1.人胎盤中存在間充質(zhì)干細(xì)胞。 2.用胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞作為滋養(yǎng)層比無滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系對CD34~+細(xì)胞有明顯的擴增效應(yīng),以HPDMSC_S作為以上三種來源的造血干細(xì)胞的滋養(yǎng)層,對胎盤來源的造血干細(xì)胞支持作用明顯優(yōu)于其他兩組,擴增了(2.6±0.17)倍(8.7±1.2)倍(16.8±2.2)倍(11.6±1.8)倍,臍血次之;擴增了(2.0±0.2)倍(4.3±1.2)倍(11.2±2.4)倍(6.7±1.9)倍;對骨髓來源的造血干細(xì)胞最差,擴增了(1.8±0.3)倍(4.6±1.1)倍(8.7±1.4)倍(4.2±0.4)倍。 結(jié)論 1人胎盤中存在胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。 2.胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞可以作為骨髓,臍血,胎盤不同來源造血干細(xì)胞體外擴增的滋養(yǎng)層,尤其適于胎盤來源的造血干細(xì)胞。 3.來源于胎盤造血干細(xì)胞生長最好,擴增倍數(shù)最高,臍血次之,骨髓最差。
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【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R329

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 王明元;干細(xì)胞分化抗原及標(biāo)記物研究進展[J];國外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊);2004年06期

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本文編號：1742872