本文選題：內皮素 + 內皮前體細胞　； 參考：《第四軍醫(yī)大學》2008年碩士論文

【摘要】： 研究背景及目的 內皮素家族包括內皮素-1(ET-1)、內皮素-2(ET-2)和內皮素-3(ET-3),均是含有21個氨基酸殘基的短肽。ET-1主要由血管內皮細胞分泌,在脈管系統(tǒng)作用最強,是已知最有力的血管收縮劑。ET-1是一種多功能調節(jié)肽,具有廣泛的生物學效應,具有介導炎癥、刺激其它激素分泌、促有絲分裂、刺激細胞增殖、移行和黏附等多種功能,通過自分泌和旁分泌方式經受體發(fā)揮作用。許多臨床和實驗研究證實ET-1作為一種血管活性肽,在血管生成過程中也發(fā)揮作用。ET-1通過直接作用于內皮細胞上的ETB受體,在新生血管的不同階段發(fā)揮調節(jié)作用,包括細胞增殖、遷移和蛋白酶的合成等,在體內實驗中ET-1也能刺激新血管生成。 內皮前體細胞(EPC)又稱內皮祖細胞,是一類能循環(huán)、增殖并分化為血管內皮細胞,但尚未表達成熟血管內皮細胞表型特征的前體細胞。研究發(fā)現(xiàn),EPC不僅參與人胚胎血管生成,同時也參與出生后血管新生和內皮損傷后的修復過程。當發(fā)生血管損傷時,內皮前體細胞從骨髓釋放入外周血,遷移至受損部位,摻入血管壁中,分化為成熟內皮細胞,修復受損血管,參與血管新生,改善甚至恢復缺血組織的血供。 本研究擬探討體外培養(yǎng)條件下,不同濃度ET-1對骨髓來源EPC的增殖、細胞周期、NO分泌和凋亡的影響,以期從新的角度理解ET-1對心血管系統(tǒng)的作用。 實驗方法 第一部分EPC的培養(yǎng)和鑒定: 1、取大鼠股骨骨髓,以密度梯度離心法分離出單核細胞,在添加了VEGF和bFGF的M199培養(yǎng)基中培養(yǎng),并定期觀察; 2、DiⅠ-ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ免疫熒光雙染,鑒定細胞表型。 第二部分ET-1對EPC增殖、細胞周期、NO分泌和凋亡的影響: 1、取培養(yǎng)5天的細胞,分別給予不同濃度ET-1干預不同時間; 2、MTT檢測細胞增殖能力; 3、流式細胞術檢測細胞周期; 4、硝酸還原酶法檢測NO分泌水平; 5、流式細胞術檢測細胞凋亡率。 統(tǒng)計學分析:數(shù)值均以x±s表示。數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,應用單因素方差分析進行統(tǒng)計學分析,有統(tǒng)計學意義的采用LSD-t檢驗進一步比較。 實驗結果 1、細胞鑒定示細胞呈DiⅠ-ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙陽性,證實所得到的細胞為EPC。 2、EPC增殖能力在ET-1干預后48h開始明顯增強(P0.05),干預72h和96h后明顯高于對照組(P0.01);在濃度為10-6mol/L時最為顯著(P0.01)。 3、ET-1能夠促進EPC向S期和G2/M期的轉化,在濃度為10-6mol/L時達到最大效應(P0.01)。 4、EPC分泌NO能力在ET-1刺激后48h開始明顯增強(P0.05),干預72h和96h后明顯高于對照組(P0.01);在濃度為10-6mol/L時最為顯著(P0.01)。 5、ET-1能夠誘導EPC凋亡,干預48h時最顯著(P0.01),72h、96h作用減弱。 結論 1、ET-1促進EPC的增殖,作用呈濃度和時間依賴性。 2、ET-1促進EPC由G0/G1期向S期和G2/M期的轉化,作用呈濃度依賴性。 3、ET-1提高細胞NO分泌功能,作用呈濃度和時間依賴性。 4、ET-1能誘導EPC凋亡,在干預48h時作用最強,之后其促凋亡作用減弱。 5、ET-1可顯著促進EPC增殖及凋亡,但以促進增殖效應為主。
[Abstract]:Background and purpose of research
The endothelin family including endothelin -1 (ET-1), endothelin -2 (ET-2) and endothelin -3 (ET-3), is a short peptide.ET-1 containing 21 amino acid residues mainly secreted by vascular endothelial cells in the vasculature, the strongest effect is the most powerful known vasoconstrictor.ET-1 is a multifunctional regulatory peptide, which has extensive biological effects. It mediates inflammation, stimulate the secretion of other hormones, mitogenic stimulation, cell proliferation, adhesion and other shift function, through autocrine and paracrine manner through the receptors. Many clinical and experimental studies confirmed that ET-1 as a vasoactive peptide, also play a role.ET-1 through the direct effect on the endothelial cells of the ETB receptor in angiogenesis play a regulatory role in the different stages of angiogenesis, including cell proliferation, migration and protein synthesis in vivo, ET-1 can also stimulate new blood Guan Shengcheng.
Endothelial progenitor cells (EPC) also known as endothelial progenitor cells, which can circulate, proliferate and differentiate into vascular endothelial cells, progenitor cells but not expression of mature endothelial cells phenotype. The study found that EPC is not only involved in embryonic angiogenesis and in postnatal angiogenesis and endothelial repair after injury process. When the occurrence of vascular injury, endothelial progenitor cells derived from bone marrow into peripheral blood and migrate to the site of injury, the incorporation of the vessel wall, differentiate into mature endothelial cells, repair damaged blood vessels involved in angiogenesis, restore or improve the blood supply of ischemic tissue.
The aim of this study is to investigate the effects of different concentrations of ET-1 on proliferation, cell cycle, NO secretion and apoptosis of bone marrow derived EPC in vitro, in order to understand the role of ET-1 in cardiovascular system from a new perspective.
Experimental method
The first part of the culture and identification of EPC:
1, the bone marrow of the rat femur was taken and the mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation, and were cultured in the M199 medium adding VEGF and bFGF and observed regularly.
2, Di I -ac-LDL and FITC-UEA- I were immunofluorescent double staining to identify the cell phenotype.
Second the effects of ET-1 on EPC proliferation, cell cycle, NO secretion and apoptosis:
1, the cells were cultured for 5 days, and the different concentrations of ET-1 were given for different time, respectively.
2, MTT was used to detect cell proliferation.
3, flow cytometry was used to detect cell cycle.
4, the nitric acid reductase method was used to detect the level of NO secretion.
5, the rate of cell apoptosis was detected by flow cytometry.
Statistical analysis: the values were all expressed as x + s. The data were statistically analyzed by SPSS11.0 statistical software. Statistical analysis was performed by one-way ANOVA, and LSD-t test was used for statistical comparison.
experimental result
1, cell identification showed that the cells were Di I -ac-LDL and FITC-UEA- I positive, which proved that the cells obtained were EPC..
2, the proliferation ability of EPC began to increase significantly after ET-1 intervention (P0.05). After intervention of 72h and 96h, the proliferation of 48h was significantly higher than that of the control group (P0.01), while 10-6mol/L was the most significant (P0.01) when the concentration was 10-6mol/L.
3, ET-1 can promote the transformation of EPC into S phase and G2/M phase, and reach the maximum effect (P0.01) when the concentration is 10-6mol/L.
4, the ability of EPC secreting NO increased significantly after ET-1 stimulation (P0.05). After intervention of 72h and 96h, the level of 48h was significantly higher than that of control group (P0.01). When 10-6mol/L concentration was the most significant (P0.01).
5, ET-1 can induce EPC apoptosis and the most significant (P0.01) in 48h intervention, and the effect of 72h and 96h is weakened.
conclusion
1, ET-1 promotes the proliferation of EPC in a concentration and time dependent manner.
2, ET-1 promotes the transformation of EPC from phase G0/G1 to S and G2/M phase, and the effect is concentration dependent.
3, ET-1 increased the function of NO secretion, and the effect was concentration and time dependent.
4, ET-1 could induce apoptosis of EPC, and the effect was strongest when 48h was intervened, and then the effect of apoptosis was weakened.
5, ET-1 can significantly promote the proliferation and apoptosis of EPC, but mainly promote the proliferation effect.

【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R329

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