發(fā)布時(shí)間：2018-04-05 04:06

  本文選題：重組免疫毒素　切入點(diǎn)：ScFv-PE40　出處：《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)》2008年碩士論文

【摘要】： 豬囊尾蚴病是危害最為嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲(chóng)病之一,該病不僅造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,而且對(duì)人類(lèi)存在著重要的健康隱患。人不僅是中間宿主,而且是唯一的終末宿主。囊尾蚴常在腦、眼、心臟等重要器官寄生,其中以寄生于神經(jīng)系統(tǒng)的腦囊蟲(chóng)病引起的臨床癥狀最為嚴(yán)重,極大危害了人類(lèi)健康。多年來(lái)防治本病主要是以藥物防治為主,但是由于抗藥性的不斷出現(xiàn)以及藥物殘留等問(wèn)題的嚴(yán)重性,使得利用免疫預(yù)防技術(shù)來(lái)取代藥物成為控制豬囊尾蚴病的必然,且在寄生蟲(chóng)學(xué)界已達(dá)成了共識(shí)。課題組已經(jīng)獲得抗豬囊尾蚴頭節(jié)抗原的單克隆抗體,并從抗體中已提取單鏈抗體ScFv,且與綠膿桿菌外毒素PE40鏈接并克隆到質(zhì)粒載體pET28a中。本試驗(yàn)?zāi)康?通過(guò)重組免疫毒素基因ScFv-PE40在大腸桿菌BL21中表達(dá)及純化,以獲得具有一定純度的重組免疫毒素,從而進(jìn)行體外六鉤蚴殺傷實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證重組免疫毒素的殺傷效果,為進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和重組毒素的應(yīng)用奠定基礎(chǔ),也為囊尾蚴病的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。 方法:首先通過(guò)CaCl_2法制作感受態(tài)大腸桿菌BL21,將含有抗囊尾蚴頭節(jié)的單鏈抗體基因(ScFv)和綠膿桿菌外毒素基因(PE40)的重組質(zhì)粒載體pET-28a轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中,培養(yǎng)后,將菌液鋪于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上37℃過(guò)夜,次日觀察菌落,并挑取12個(gè)菌落分別培養(yǎng)后,提取質(zhì)粒,用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定,進(jìn)而進(jìn)行特異性的IPTG誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)SDS-PAGE和Western-Blotting分析鑒定,以檢測(cè)蛋白的反應(yīng)原性。將目的蛋白通過(guò)金屬Ni~(2+)親和層析柱純化,純化后,通過(guò)體外六鉤蚴殺傷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目的蛋白的殺傷作用,同時(shí)繪制殺傷曲線,為進(jìn)一步的活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ),同時(shí)也為囊尾蚴疾病的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。 結(jié)果:將含有pET28-ScFv-PE40的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中后,提取質(zhì)粒,用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,在約5400bp處和約1800bp處各有一條核酸條帶,核酸長(zhǎng)度與事先序列測(cè)定長(zhǎng)度相同,說(shuō)明菌中所含質(zhì)粒為目的質(zhì)粒。將E.coli BL21(DE3)通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE分析,ScFv-PE40基因獲得了表達(dá),各小時(shí)的表達(dá)量幾乎無(wú)差別,表達(dá)蛋白的相對(duì)分子量約為68kDa(3.5 kDa的pET-28a肽段和68 kDaScFv-PE40),表達(dá)量約占菌體總蛋白的13.8%。而含空質(zhì)粒pET-28a的對(duì)照組則未見(jiàn)大小一致的蛋白質(zhì)表達(dá)。為了進(jìn)一步鑒定表達(dá)產(chǎn)物,將表達(dá)的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF轉(zhuǎn)移膜上,進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析,可見(jiàn)68 kDa處有一條明顯的蛋白印跡帶,說(shuō)明目的蛋白具有一定的反應(yīng)原性。通過(guò)金屬Ni~(2+)親和層析柱純化目的蛋白后,在約68×10~3處有一條蛋白富集帶,位置與融合蛋白pET28-ScFv-PE40的表達(dá)蛋白相一致。SDS-PAGE分析表明,純化后目的蛋白的純度在95%以上,可溶性蛋白的回收率約為50%,回收量為5mg/L。將純化的目的蛋白進(jìn)行體外六鉤蚴殺傷實(shí)驗(yàn),并繪制殺傷曲線。由細(xì)胞殺傷曲線可得,隨著時(shí)間的推移,處理組和對(duì)照組形態(tài)完整六鉤蚴的數(shù)目均呈逐漸減少趨勢(shì),但加入重組毒素組形態(tài)完整六鉤蚴數(shù)目的下降明顯快于對(duì)照組(P＜0.05),并且比較三個(gè)殺傷曲線,可見(jiàn)隨著重組免疫毒素劑量的減少,處理組下降逐漸減慢,表明重組毒素對(duì)六鉤蚴具有較強(qiáng)的殺滅作用,但是重組毒素對(duì)六鉤蚴的作用有一定的劑量依賴(lài)性。
[Abstract]:In this study , we have obtained the monoclonal antibodies against the disease of human beings , such as brain , eye , heart and so on , and have already reached a consensus in the field of parasite .


Methods : The recombinant plasmid pET - 28a ( pET - 28a ) was transformed into E . coli BL21 ( BL21 ) by CaCl2 method . After incubation , the recombinant plasmid pET - 28a was cultured on LB solid medium containing kanamycin . After the culture , the recombinant plasmid was purified and purified by SDS - PAGE and Western - Blotting analysis . The target protein was purified by SDS - PAGE and Western - Blotting . The target protein was purified by SDS - PAGE and Western Blotting .


The results showed that the recombinant plasmid pET - 28a was transformed into E . coli BL21 , the plasmid was extracted , digested with EcoRI and HindIII . The expression of the recombinant toxin was about 68 kDa ( pET - 28a peptide fragment and 68 kDascFv - PE40 ) .

【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R346;S855.99

【參考文獻(xiàn)】

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1 易學(xué)瑞,余宙耀,張宜俊,章谷生;基因工程抗體表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊(cè);2000年01期

2 羅良生,黃強(qiáng);基因重組免疫毒素研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊(cè));2000年05期

3 尹繼剛,張西臣,李建華,朱平,柳增善;抗隱孢子蟲(chóng)子孢子ScFv-PE40免疫毒素表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達(dá)[J];寄生蟲(chóng)與醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)學(xué)報(bào);2005年03期

4 馮樹(shù)梅,才學(xué)鵬;囊蟲(chóng)病的免疫學(xué)研究現(xiàn)狀[J];中國(guó)獸醫(yī)科技;2000年08期

5 姜秀云,韓宇;豬囊尾蚴逃避宿主防御攻擊機(jī)制的研究進(jìn)展[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2001年05期

6 張唯哲,徐之杰,趙育瑩,王文余;囊蟲(chóng)病患者 IL-2 及 sIL-2R 測(cè)定[J];中國(guó)寄生蟲(chóng)病防治雜志;1997年02期

7 劉永杰,李慶章,郝艷紅;豬帶絳蟲(chóng)囊尾蚴的發(fā)育過(guò)程及形態(tài)觀察[J];中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志;2002年05期

8 溫儒民,薛松,孫曉青,陳家存,顧驤,陳仁富,鄭駿年;抗膀胱癌免疫毒素BDI-1-PEA特異殺傷腫瘤細(xì)胞的研究[J];中國(guó)腫瘤生物治療雜志;2004年01期

9 唐雨德,顧志香,劉玉,郁興明;應(yīng)用小鼠動(dòng)物模型進(jìn)行豬囊蟲(chóng)病免疫預(yù)防的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)人獸共患病雜志;2000年06期

10 閆玉文，張文玉，，朱麗賢，王文余;人體囊蟲(chóng)病發(fā)病過(guò)程中IgE和IgG介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[J];中國(guó)人獸共患病雜志;1994年03期

本文編號(hào)：1713105