本文選題：重組免疫毒素　切入點：ScFv-PE40　出處：《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)》2008年碩士論文

【摘要】： 豬囊尾蚴病是危害最為嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病之一,該病不僅造成巨大的經(jīng)濟損失,而且對人類存在著重要的健康隱患。人不僅是中間宿主,而且是唯一的終末宿主。囊尾蚴常在腦、眼、心臟等重要器官寄生,其中以寄生于神經(jīng)系統(tǒng)的腦囊蟲病引起的臨床癥狀最為嚴(yán)重,極大危害了人類健康。多年來防治本病主要是以藥物防治為主,但是由于抗藥性的不斷出現(xiàn)以及藥物殘留等問題的嚴(yán)重性,使得利用免疫預(yù)防技術(shù)來取代藥物成為控制豬囊尾蚴病的必然,且在寄生蟲學(xué)界已達成了共識。課題組已經(jīng)獲得抗豬囊尾蚴頭節(jié)抗原的單克隆抗體,并從抗體中已提取單鏈抗體ScFv,且與綠膿桿菌外毒素PE40鏈接并克隆到質(zhì)粒載體pET28a中。本試驗?zāi)康?通過重組免疫毒素基因ScFv-PE40在大腸桿菌BL21中表達及純化,以獲得具有一定純度的重組免疫毒素,從而進行體外六鉤蚴殺傷實驗,驗證重組免疫毒素的殺傷效果,為進一步動物實驗和重組毒素的應(yīng)用奠定基礎(chǔ),也為囊尾蚴病的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。 方法:首先通過CaCl_2法制作感受態(tài)大腸桿菌BL21,將含有抗囊尾蚴頭節(jié)的單鏈抗體基因(ScFv)和綠膿桿菌外毒素基因(PE40)的重組質(zhì)粒載體pET-28a轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中,培養(yǎng)后,將菌液鋪于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上37℃過夜,次日觀察菌落,并挑取12個菌落分別培養(yǎng)后,提取質(zhì)粒,用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定,進而進行特異性的IPTG誘導(dǎo)表達,表達產(chǎn)物通過SDS-PAGE和Western-Blotting分析鑒定,以檢測蛋白的反應(yīng)原性。將目的蛋白通過金屬Ni~(2+)親和層析柱純化,純化后,通過體外六鉤蚴殺傷實驗檢測目的蛋白的殺傷作用,同時繪制殺傷曲線,為進一步的活體動物實驗奠定基礎(chǔ),同時也為囊尾蚴疾病的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。 結(jié)果:將含有pET28-ScFv-PE40的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中后,提取質(zhì)粒,用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,在約5400bp處和約1800bp處各有一條核酸條帶,核酸長度與事先序列測定長度相同,說明菌中所含質(zhì)粒為目的質(zhì)粒。將E.coli BL21(DE3)通過IPTG誘導(dǎo)表達,經(jīng)SDS-PAGE分析,ScFv-PE40基因獲得了表達,各小時的表達量幾乎無差別,表達蛋白的相對分子量約為68kDa(3.5 kDa的pET-28a肽段和68 kDaScFv-PE40),表達量約占菌體總蛋白的13.8%。而含空質(zhì)粒pET-28a的對照組則未見大小一致的蛋白質(zhì)表達。為了進一步鑒定表達產(chǎn)物,將表達的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF轉(zhuǎn)移膜上,進行蛋白質(zhì)印跡分析,可見68 kDa處有一條明顯的蛋白印跡帶,說明目的蛋白具有一定的反應(yīng)原性。通過金屬Ni~(2+)親和層析柱純化目的蛋白后,在約68×10~3處有一條蛋白富集帶,位置與融合蛋白pET28-ScFv-PE40的表達蛋白相一致。SDS-PAGE分析表明,純化后目的蛋白的純度在95%以上,可溶性蛋白的回收率約為50%,回收量為5mg/L。將純化的目的蛋白進行體外六鉤蚴殺傷實驗,并繪制殺傷曲線。由細(xì)胞殺傷曲線可得,隨著時間的推移,處理組和對照組形態(tài)完整六鉤蚴的數(shù)目均呈逐漸減少趨勢,但加入重組毒素組形態(tài)完整六鉤蚴數(shù)目的下降明顯快于對照組(P＜0.05),并且比較三個殺傷曲線,可見隨著重組免疫毒素劑量的減少,處理組下降逐漸減慢,表明重組毒素對六鉤蚴具有較強的殺滅作用,但是重組毒素對六鉤蚴的作用有一定的劑量依賴性。
[Abstract]:In this study , we have obtained the monoclonal antibodies against the disease of human beings , such as brain , eye , heart and so on , and have already reached a consensus in the field of parasite .


Methods : The recombinant plasmid pET - 28a ( pET - 28a ) was transformed into E . coli BL21 ( BL21 ) by CaCl2 method . After incubation , the recombinant plasmid pET - 28a was cultured on LB solid medium containing kanamycin . After the culture , the recombinant plasmid was purified and purified by SDS - PAGE and Western - Blotting analysis . The target protein was purified by SDS - PAGE and Western - Blotting . The target protein was purified by SDS - PAGE and Western Blotting .


The results showed that the recombinant plasmid pET - 28a was transformed into E . coli BL21 , the plasmid was extracted , digested with EcoRI and HindIII . The expression of the recombinant toxin was about 68 kDa ( pET - 28a peptide fragment and 68 kDascFv - PE40 ) .

【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R346;S855.99

【參考文獻】

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本文編號：1713105