本文選題：慢性乙型肝炎　切入點(diǎn)：乙肝表面抗原　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染引起的乙型肝炎(簡(jiǎn)稱“乙肝”)是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病。全球約有三億五千萬乙肝患者及無癥狀攜帶者,其中近一半在中國(guó)。大部分新生兒以及約5%左右的成年人感染HBV后不能及時(shí)清除病毒而發(fā)展為慢性肝炎。HBV慢性持續(xù)性感染與肝硬化、肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)。 目前研究認(rèn)為免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的宿主與病毒的相互作用決定著HBV感染后病毒的清除和肝炎病變的進(jìn)程。IFN-α(Interferon-α)能夠誘導(dǎo)多種抗病毒蛋白表達(dá),并且能夠激活先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答從而發(fā)揮強(qiáng)大的抗病毒效應(yīng),是目前臨床上治療慢性乙肝(CHB)感染的一線藥物,并取得相對(duì)較好的治療效果。宿主體內(nèi)外周血干擾素-α主要由外周血中的漿樣樹突狀細(xì)胞(pDCs)產(chǎn)生,因此,pDCs及其分泌的干擾素在宿主抗病毒過程中扮演重要角色。 有大量研究表明慢性乙肝患者外周血中pDCs數(shù)量下降且功能受損,且CHB患者經(jīng)拉米夫定抗病毒治療,病毒載量降到檢測(cè)水平以下時(shí),pDCs的數(shù)量出現(xiàn)回復(fù)性升高,提示HBV可能影響了pDCs的數(shù)量和功能,并推測(cè)這可能是HBV導(dǎo)致慢性持續(xù)性感染的原因之一。目前pDCs受HBV影響的具體機(jī)制還不清楚,本課題擬對(duì)此作進(jìn)一步探索。 首先證實(shí)慢性乙肝患者PBMCs用Toll樣受體9(TLR9)的配體CpG A刺激后,其產(chǎn)生IFN-α的能力與正常人相比明顯減弱,結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道的CHB病人外周血中pDCs功能受損一致。乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)在患者肝臟以及血液中大量存在,推測(cè)其可能在HBV感染慢性化過程中扮演了重要的角色。 為明確HBsAg參與影響了外周血免疫細(xì)胞產(chǎn)生干擾素的功能,在體外實(shí)驗(yàn)中用自病人血漿純化的HBsAg預(yù)處理正常人的PBMCs,再經(jīng)TLR7配體Gardiquimod或TLR9配體CpG A刺激,發(fā)現(xiàn)PBMCs產(chǎn)生IFN-α的能力較未作HBsAg預(yù)處理時(shí)明顯降低,推測(cè)HBsAg抑制了PBMCs中pDCs分泌IFN-α的能力。然而當(dāng)用HBsAg預(yù)處理自正常人純化的pDCs,發(fā)現(xiàn)HBsAg并不能抑制TLR7和TLR9介導(dǎo)的IFN-α的產(chǎn)生。上述結(jié)果表明HBsAg可能通過PBMCs中的某些細(xì)胞或細(xì)胞因子作用于pDCs,從而間接抑制了IFN-α的分泌。 為證實(shí)上述假設(shè),本研究進(jìn)一步探討了HBsAg間接抑制pDCs IFN-α產(chǎn)生的可能途徑。鑒于單核細(xì)胞在外周血中占有較高比例并為重要的抗原提呈細(xì)胞,磁珠分選單核細(xì)胞和pDCs,將單核細(xì)胞與pDCs以一定比例共孵育,經(jīng)HBsAg預(yù)處理及CpG A刺激,發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞能夠明顯加強(qiáng)HBsAg對(duì)pDCs IFN-α產(chǎn)生的抑制作用,且隨著單核細(xì)胞數(shù)量的增加,HBsAg抑制IFN-α產(chǎn)生的現(xiàn)象也更加明顯。此外,HBsAg基本不能抑制剔除單核細(xì)胞的PBMCs中IFN-α產(chǎn)生的作用,提示單核細(xì)胞在HBsAg抑制pDCs IFN-α分泌中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。為進(jìn)一步明確單核細(xì)胞對(duì)pDCs的作用途徑是通過細(xì)胞與細(xì)胞之間的直接接觸作用或是通過分泌細(xì)胞因子間接作用,采用transwell小室將單核細(xì)胞和pDCs分隔開,重復(fù)HBsAg處理及CpG A刺激后pDCs IFN-α的分泌情況。結(jié)果顯示單核細(xì)胞和pDCs分隔開后,HBsAg仍然能夠明顯抑制pDCs中IFN-α產(chǎn)生,提示單核細(xì)胞通過分泌某些細(xì)胞因子來影響間接影響pDCs的功能。 鑒于TFN-α(Tumor necrosis factor-α)和IL-10 (Interleukin-10)為單核細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子,且已有報(bào)道TFN-α和IL-10能夠抑制pDCs IFN-α產(chǎn)生,檢測(cè)了存在HBsAg抑制IFN-α產(chǎn)生現(xiàn)象的pDCs和單核細(xì)胞共孵育體系、PBMCs以及不存在抑制現(xiàn)象的pDCs上清中TNF-α、IL-10的分泌情況,結(jié)果顯示經(jīng)HBsAg預(yù)處理的PBMCs及pDCs和單核細(xì)胞共孵育組中TNF-α的分泌顯著升高,單純pDCs組并未見顯著升高。而在體外用HBsAg處理純化的單核細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)HBsAg能夠以劑量依賴的方式誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌TNF-α、IL-10。同時(shí),在剔除單核細(xì)胞的PBMCs中,HBsAg則基本不能誘導(dǎo)這兩種細(xì)胞因子的分泌,進(jìn)一步確認(rèn)TNF-α和IL-10主要是由單核細(xì)胞所分泌。為確認(rèn)TNF-α和IL-10對(duì)pDC功能的抑制作用,在體外向PBMCs中外源性添加TNF-α、IL-10,發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞因子能夠不同程度地抑制PBMCs和pDCs IFN-α產(chǎn)生。進(jìn)一步的細(xì)胞因子中和抗體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),經(jīng)TNF-α和IL-10的中和抗體預(yù)處理后,HBsAg對(duì)于IFN-α產(chǎn)生的抑制作用明顯減弱。上述結(jié)果證實(shí)由單核細(xì)胞分泌的TNF-α和IL-10在介導(dǎo)HBsAg抑制pDCs產(chǎn)生IFN-α中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。 為了解釋TNF-α和IL-10對(duì)pDCs分泌IFN-α功能的抑制作用,初步探討了TNF-α和IL-10對(duì)pDCs中TLR9介導(dǎo)IFN-α生成信號(hào)通路的影響。研究結(jié)果顯示,TNF-α和IL-10可下調(diào)pDCs中TLR9受體的表達(dá),推測(cè)可能是TNF-α和IL-10抑制IFN-α產(chǎn)生的機(jī)制之一 綜上所述,本研究證實(shí)乙肝表面抗原可以抑制外周血pDCs分泌IFN-α,并且這種抑制作用由乙肝表面抗原誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子TNF-α和IL-10所介導(dǎo),而下調(diào)pDCs中TLR9受體的表達(dá)可能為兩種細(xì)胞因子抑制pDCs中IFN-α產(chǎn)生的機(jī)制之一。本研究結(jié)果可能部分詮釋乙肝病毒感染慢性化的機(jī)理,即乙肝病毒利用HBsAg鈍化天然免疫系統(tǒng)而建立慢性持續(xù)性感染,還為探索慢性乙肝免疫治療的新方法提供了新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:Hepatitis B ( " hepatitis B " ) caused by hepatitis B virus ( HBV ) infection is a major disease which seriously endangers the human health . About 300 million hepatitis B patients and asymptomatic carriers are in the world . About half of them are in China . Most of the newborns and about 5 % of adults are infected with HBV . The virus can not be removed in time to develop into chronic hepatitis . Chronic persistent infection of HBV is closely related to the occurrence of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma .


IFN - 偽 ( IFN - 偽 ) can induce multiple antiviral protein expression , and can activate innate and adaptive immune responses to exert a strong antiviral effect . It is a first - line drug for the treatment of chronic hepatitis B virus infection . The peripheral blood interferon - 偽 is mainly produced by plasma - like dendritic cells ( pDCs ) in peripheral blood . Therefore , pDCs and their secreted interferon play an important role in the antiviral process of the host .


A large number of studies have shown that the number of pDCs in the peripheral blood of patients with chronic hepatitis B is decreased and the function is impaired , and the number of pDCs increases in response to lamivudine antiviral therapy , suggesting that HBV may affect the number and function of pDCs , and suggest that this may be one of the causes of chronic persistent infection by HBV . The specific mechanism of the present pDCs to be affected by HBV is not clear , and the subject is to be further explored .


The results are consistent with the function of pDCs in the peripheral blood of patients with chronic hepatitis B . The results are in agreement with the function of pDCs in the peripheral blood of patients with chronic hepatitis B . The results are consistent with the function of pDCs in the peripheral blood of patients with chronic hepatitis B . The presence of HBsAg in the liver and blood of patients is presumed to play an important role in the chronic process of HBV infection .


It was found that HBsAg could not inhibit the production of IFN - 偽 in PBMCs . However , it was found that HBsAg could not inhibit the production of IFN - 偽 mediated by TLR7 and TLR9 in vitro . However , it was found that HBsAg could not inhibit the production of IFN - 偽 mediated by TLR7 and TLR9 . However , when HBsAg was used to treat pDCs purified from normal persons , it was found that HBsAg could not inhibit the secretion of IFN - 偽 through some cells or cytokines in PBMCs .


In order to confirm the hypothesis , this study further discusses the possible ways of indirectly inhibiting the production of IFN - 偽 in pDCs by HBsAg . In addition , HBsAg can not inhibit the production of IFN - 偽 by HBsAg pretreatment and CpG - A stimulation . In addition , HBsAg can not inhibit the secretion of IFN - 偽 in pDCs . The results show that HBsAg can inhibit the production of IFN - 偽 in pDCs . The results show that HBsAg can inhibit the production of IFN - 偽 in pDCs .


TNF - 偽 and IL - 10 were induced by HBsAg in PBMCs and monocytes . The results showed that both TNF - 偽 and IL - 10 inhibited the secretion of TNF - 偽 and IL - 10 in PBMCs and monocytes .


In order to explain the inhibitory effect of TNF - 偽 and IL - 10 on the secretion of IFN - 偽 in pDCs , the effects of TNF - 偽 and IL - 10 on the signal pathway mediated by TLR9 in pDCs were investigated . The results showed that TNF - 偽 and IL - 10 could downregulate the expression of TLR9 receptors in pDCs , suggesting that TNF - 偽 and IL - 10 could inhibit the production of IFN - 偽 .


In conclusion , this study confirms that hepatitis B surface antigen can inhibit the secretion of IFN - 偽 from peripheral blood pDCs , and this inhibitory effect is mediated by cytokines TNF - 偽 and IL - 10 induced by the surface antigen of hepatitis B . The results of this study may partially explain the mechanism of chronic hepatitis B virus infection , that is , hepatitis B virus establishes chronic persistent infection with HBsAg passive natural immune system , and provides a new theoretical basis and experimental basis for exploring the new method of chronic hepatitis B immunotherapy .

【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1713038