本文選題：定向造血　切入點(diǎn)：AGM區(qū)　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2010年碩士論文

【摘要】： 胚胎造血發(fā)育一直是造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSC)生物學(xué)的研究熱點(diǎn),分為原始和定向造血兩個(gè)階段。后者以淋巴細(xì)胞和HSC的產(chǎn)生為標(biāo)志。近三十年來,對淋巴系統(tǒng)和HSC的起源認(rèn)識(shí)由胚外的卵黃囊逐漸轉(zhuǎn)移到胚內(nèi)的主動(dòng)脈-性腺-中腎區(qū)(aorta-gonad-mesonephros region, AGM region, AGM區(qū))。Cumano等發(fā)現(xiàn):胚胎循環(huán)建立前,胚內(nèi)的臟壁層而非胚外的卵黃囊可通過與基質(zhì)細(xì)胞和胸腺組織塊共培養(yǎng)在體外產(chǎn)生B和T淋巴細(xì)胞。然而,該結(jié)論并未在其它實(shí)驗(yàn)室和通過其它培養(yǎng)體系得以驗(yàn)證。與淋系的體外分化系統(tǒng)相比,通過移植和連續(xù)移植長期重建(4-6個(gè)月)致死劑量照射的成體小鼠的造血系統(tǒng)是鑒定HSC的金標(biāo)準(zhǔn)。主流觀點(diǎn)認(rèn)為小鼠E10.5的AGM區(qū)是最早自主產(chǎn)生HSC的位點(diǎn)。近期,研究者發(fā)現(xiàn)HSC在胚外的胎盤組織出現(xiàn)的時(shí)間與AGM區(qū)幾乎相當(dāng),且在數(shù)量上顯著多于AGM區(qū),提示HSC的發(fā)生是多位點(diǎn)的。既往研究發(fā)現(xiàn):小鼠E9胚胎的頭部含有典型的造血祖細(xì)胞,同時(shí)還表達(dá)SCL/Tal、GATA1等造血標(biāo)志。但是,該部位是否具有定向造血的潛能尚屬未知。 本研究的第一部分,為明確能自主產(chǎn)生淋系的解剖部位,我們選取小鼠E8.5胚胎(1-7體節(jié))的卵黃囊(胚外)和臟壁層(胚內(nèi))作為實(shí)驗(yàn)對象,此時(shí)血液循環(huán)尚未建立。在標(biāo)準(zhǔn)的集落形成實(shí)驗(yàn)中,兩者均能產(chǎn)生典型的造血集落,但類型有差異。通過OP9共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn):臟壁層可產(chǎn)生B淋巴細(xì)胞,它們表達(dá)B220、CD19和IgM。采用三步法在OP9-DL1上誘導(dǎo)臟壁層至第16天,可產(chǎn)生CD44-/CD25+幼稚T細(xì)胞前體以及CD4+/CD8-單陽性T細(xì)胞。然而,上述共培養(yǎng)體系均不能誘導(dǎo)卵黃囊產(chǎn)生B和T淋巴細(xì)胞。我們的研究表明:與卵黃囊相比,臟壁層具有較強(qiáng)的體外淋系分化潛能。 本研究的第二部分,我們從髓系祖細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、HSC三個(gè)方面比較了胚胎AGM區(qū)和頭部的造血特點(diǎn)。首先,分離E9.5-E12.5小鼠胚胎的尾部(caudal half,簡稱CH,該位點(diǎn)在E10.5發(fā)育成AGM區(qū))/AGM區(qū)和頭部,利用Ⅰ型膠原酶消化成單細(xì)胞,按照一定的胚胎當(dāng)量(embryo equivalents, ee)接種于造血集落培養(yǎng)體系(含有SCF、IL-3、IL-6、Epo等造血因子)。第4天觀察發(fā)現(xiàn)CH/AGM區(qū)和頭部均產(chǎn)生了CFU-E,第7天出現(xiàn)CFU-GM,繼而出現(xiàn)CFU-Mix。我們發(fā)現(xiàn)E9.5小鼠頭部細(xì)胞產(chǎn)生的造血集落多為紅系且致密,而CFU-GM較少。E10.5之后,CFU-GM明顯增多。AGM區(qū)的粒單系集落形態(tài)均一,呈圓形或者橢圓形,而頭部的粒單系集落較大,細(xì)胞較分散,形狀不規(guī)則。此外,我們還研究了CH/AGM區(qū)和頭部的髓系造血祖細(xì)胞(即CFU-C)的發(fā)育動(dòng)力學(xué),發(fā)現(xiàn)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(E9.5-E12.5)的CH/AGM區(qū)的CFU-C的數(shù)量變化不大。相反,與E10.5相比,E11.5頭部的CFU-C數(shù)量顯著增加達(dá)到高峰,之后又逐漸減少。利用磁珠分選,發(fā)現(xiàn)AGM區(qū)和頭部的CFU-C集中于Tie2+細(xì)胞群。上述結(jié)果表明:小鼠胚胎AGM區(qū)和頭部均存在髓系造血祖細(xì)胞,但兩者在祖細(xì)胞的類型和發(fā)育動(dòng)力學(xué)等方面存在差異。 之后,我們考察了CH/AGM區(qū)和頭部的淋系發(fā)育潛能。我們利用OP9基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系考察B細(xì)胞的分化潛能。在SCF、FL、IL-7等細(xì)胞因子的作用下,第3-4天時(shí)OP9上有細(xì)胞簇出現(xiàn),隨后出現(xiàn)顯著的半貼壁細(xì)胞擴(kuò)增,其形態(tài)類似淋巴細(xì)胞。第7-10天收集上述細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)(代表性數(shù)據(jù)):CH誘導(dǎo)獲得的細(xì)胞表達(dá)B220(23.0%)、CD19(25.0%);頭部細(xì)胞的B220、CD19的陽性率分別為:36.7%和25.8%。上述結(jié)果表明E9.5小鼠的CH和頭部細(xì)胞均具有B細(xì)胞潛能。同樣,分離E9.5小鼠胚胎的CH和頭部,利用磁珠分選獲得Tie2+細(xì)胞,接種于OP9-DL1細(xì)胞上,在SCF、FL、IL-7等細(xì)胞因子作用下,發(fā)現(xiàn)OP9-DL1上有大量淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞增殖。在連續(xù)的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測發(fā)現(xiàn):隨著體外誘導(dǎo)時(shí)間的延長(7天、13天、19天、26天),幼稚的T細(xì)胞前體(CD44-/CD25+,DN3)、較成熟的雙陽性細(xì)胞(CD4+/CD8+)以及CD3+/TCRβ+的比例均逐漸增加。至第26天時(shí)(代表性數(shù)據(jù)),頭部與CH的變化趨勢基本一致,上述3種細(xì)胞亞群的比例分別達(dá)到20.1%、7.5%、8.2%。上述結(jié)果表明:在相同的誘導(dǎo)條件下,小鼠E9.5的CH和頭部細(xì)胞均能夠分化為T淋巴細(xì)胞,說明兩個(gè)位點(diǎn)均具有T淋巴細(xì)胞潛能。 最后,我們考察了AGM區(qū)和頭部的HSC潛能。分離E12.5GFP轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎的AGM區(qū)和頭部,消化成單細(xì)胞后通過尾靜脈進(jìn)行移植。移植后5個(gè)月,采集受體外周血進(jìn)行流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn):AGM區(qū)(n=11)和頭部(n=21)的重建比例相近(45% Vs 62%),嵌合率亦相似(49.±19.0% Vs 50.±22.1%)。上述數(shù)據(jù)表明:E12.5的AGM區(qū)和頭部含有的細(xì)胞均具有長期重建致死劑量照射小鼠造血系統(tǒng)的能力。利用磁珠分選后移植發(fā)現(xiàn),AGM區(qū)和頭部的Tie2+細(xì)胞均能重建致死劑量照射受體。這些結(jié)果表明,具有體內(nèi)造血活性的頭部細(xì)胞表達(dá)Tie2,與同期的其它造血組織類似。為檢測E12.5小鼠胚胎AGM區(qū)和頭部細(xì)胞移植后的多系嵌合潛能,我們對受體外周血進(jìn)行了髓系(Mac-1,Gr-1)和淋系(B220,CD3)嵌合率的檢測,發(fā)現(xiàn):無論是AGM區(qū)還是頭部細(xì)胞移植后的陽性受體,其外周血都有相當(dāng)比例的供體來源的髓系和淋系嵌合。此外,我們對部分重建受體的骨髓、脾臟、胸腺進(jìn)行了檢測,發(fā)現(xiàn)AGM區(qū)和頭部來源的造血細(xì)胞均能在這些成體造血組織高比例嵌合,說明E12.5小鼠胚胎的頭部和AGM區(qū)的造血細(xì)胞具有體內(nèi)多系分化潛能。為驗(yàn)證上述造血細(xì)胞的自我更新能力,我們應(yīng)用已重建受體的骨髓細(xì)胞進(jìn)行二次移植,2個(gè)月后檢測發(fā)現(xiàn)所有受體全部重建,說明AGM區(qū)和頭部造血細(xì)胞具有自我更新能力�；趦蓚�(gè)位點(diǎn)來源的造血細(xì)胞在體內(nèi)能夠自我更新和多向分化,證明小鼠E12.5的AGM區(qū)和頭部均含有真正的HSC。
[Abstract]:Embryonic hematopoietic growth has been a hot spot in the biology of hematopoietic stem cells ( HSC ) , which is divided into two phases : primary and direct hematopoietic . The latter is marked by the production of lymphocytes and HSCs . In the last 30 years , the origin of lymphatic system and HSC is recognized . Cumano et al . found that it was possible to produce B and T lymphocytes in vitro by co - culture with stromal cells and thymus tissue blocks . However , this conclusion was not validated in other laboratories and by other culture systems .


In the first part of this study , we selected the yolk sac ( outer layer ) and the visceral wall ( embryo ) of mouse E8.5 embryo ( 1 - 7 ) as the experimental subject . At this time , the blood circulation has not been established . In the standard colony formation experiment , it is possible to produce B lymphocytes .


In the second part of this study , we compared the hematopoietic characteristics of the embryonic agm region and the head from three aspects of myeloid progenitor cells , lymphocytes and HSC . First , the tail part ( abbreviated as CH , which was developed into agm region at E10 . 5 ) / agm region and head were isolated from the three aspects of myeloid progenitor cells , lymphocytes and HSCs . CFU - GM and CFU - GM were observed in the head cells of E9.5 - E11.5 . CFU - C in the head of E11.5 was significantly higher than that of E10 . 5 . The CFU - C of the head was larger than that of E10 . 5 .


The results showed that both CH and head cells of E9 - DL1 had the potential of B - cell . The results showed that both CH and head cells of E9 - DL1 were able to differentiate into T - lymphocytes at the same induction conditions . The results showed that both the CH and the head cells of the mice were able to differentiate into T - lymphocytes , and the results showed that both sites had the potential of T - lymphocyte .


Finally , we investigated the potential of the HSC in the agm region and the head , and separated the agm region and the head part of the e12 . 5GFP transgenic mouse embryo , digested into single cells and then transplanted through the tail vein . After transplantation for 5 months , the collected receptor ' s peripheral blood was subjected to flow cytometry analysis . The results showed that the reconstructed ratio of the agm region ( n = 11 ) and the head ( n = 21 ) was similar ( 45 % Vs 62 % ) , and the chimerism rate was similar ( 49 . 鹵 19 . 0 % Vs 50 . 鹵 22.1 % ) . In order to verify the self - renewal ability of marrow , spleen and thymus , we found that all the hematopoietic cells in the head and the head of E12.5 mice had the potential of self - renewal . In order to verify the self - renewal ability of these hematopoietic cells , we found that all the recipients were self - renewing . In addition , we found that all the hematopoietic cells from both the agm region and the head had self - renewal ability .

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張緒超;陳惠芹;黃紹良;吳北燕;黃永蘭;蔡耘;;含人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系定向誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞為造血干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國病理生理雜志;2007年09期

2 謝淑;蔡彥寧;謝淑;蔡彥寧;關(guān)云謙;關(guān)云謙;武文琪;徐艷玲;張愚;徐艷玲;張愚;陳彪;陳彪;謝淑;蔡彥寧;陳彪;;時(shí)鐘基因在胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)元過程中的表達(dá)特征[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2007年45期

3 李朋粉;孫瑩璞;;胚胎干細(xì)胞維持基因組穩(wěn)定性機(jī)制的研究進(jìn)展[J];國際生殖健康/計(jì)劃生育雜志;2009年03期

4 張?jiān)势?王英杰;張世昌;劉濤;;ES細(xì)胞的三維培養(yǎng)與肝細(xì)胞分化的初步研究[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2008年08期

5 邢變枝;陳紅;錢坤;湛彥強(qiáng);張?zhí)K明;;胚胎干細(xì)胞定向分化為脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2009年01期

6 胡安斌;何曉順;黃冰;蔡繼業(yè);;上皮型鈣粘蛋白在小鼠胚胎干細(xì)胞體外分化中動(dòng)態(tài)表達(dá)及與細(xì)胞黏附狀態(tài)關(guān)系[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2009年45期

7 劉濤;王英杰;張世昌;陳霞;李桂清;;胚胎干細(xì)胞用于肝組織工程研究的初步評價(jià)[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2009年09期

8 任萌;閔軍;嚴(yán)勵(lì);商昌珍;曹君;李靜宜;程樺;;丁酸鈉、激活素A和地塞米松誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為胰腺外分泌細(xì)胞[J];中國病理生理雜志;2009年08期

9 李永芳;;胚胎干細(xì)胞及其在人類疾病治療中的應(yīng)用[J];泰山學(xué)院學(xué)報(bào);2005年06期

10 歐東波;陳瑞;鄭強(qiáng)蓀;郭菁菁;郭萬剛;劉雄濤;;胚胎干細(xì)胞在體外模擬心肌生長環(huán)境中向心肌分化[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2009年04期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 姚玲玲;朱依純;;胚胎干細(xì)胞分化潛能研究進(jìn)展[A];中國生理學(xué)會(huì)論文匯編2004年第二期[C];2004年

2 秦茂林;蔡文琴;張吉強(qiáng);李成仁;李巍;;雌二醇對胚胎干細(xì)胞神經(jīng)定向分化誘導(dǎo)的影響[A];中國解剖學(xué)會(huì)第十一屆全國組織學(xué)與胚胎學(xué)青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2009年

3 丁明孝;鄧宏魁;;胚胎干細(xì)胞向胰腺B細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化的研究[A];第二屆中國醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)暨細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)改革會(huì)議論文集[C];2008年

4 劉平;關(guān)云謙;鄒春林;張愚;陳彪;劉焯霖;;胚胎干細(xì)胞在體內(nèi)外誘導(dǎo)分化成為多巴胺能神經(jīng)的初步研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

5 張劍;韓雅玲;康建;閆承慧;張效林;齊巖梅;李少華;;持續(xù)活化和主導(dǎo)抑制Rac1對胚胎干細(xì)胞分化為成血管細(xì)胞的調(diào)控作用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)第十次全國心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議匯編[C];2008年

6 顏培實(shí);林海龍;孫喜琢;宋道嶺;;環(huán)胞霉素A具有顯著的促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向心肌前驅(qū)干細(xì)胞特異性分化的作用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第11次心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

7 周名亮;李謐;馬俊榮;余希杰;;Nf1基因缺失的胚胎干細(xì)胞模擬NF1成骨細(xì)胞的異常發(fā)育及分化[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第三次骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病中青年學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

8 徐小明;竇忠英;華進(jìn)聯(lián);葛秀國;;免疫外科法分離克隆BALB/c小鼠胚胎干細(xì)胞[A];全國首屆動(dòng)物生物技術(shù)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2004年

9 于洲;;小鼠胚胎干細(xì)胞發(fā)育毒性體外篩選模型建立及其應(yīng)用的研究[A];第四屆第二次中國毒理學(xué)會(huì)食品毒理學(xué)專業(yè)委員會(huì)與營養(yǎng)食品所毒理室聯(lián)合召開學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2008年

10 熊吉信;劉兆軒;劉小春;楊春江;;小鼠胚胎干細(xì)胞體外定向分化為血管平滑肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[A];2009全國中西醫(yī)結(jié)合周圍血管疾病學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2009年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 張樹庸　趙貴英;干細(xì)胞研究的突破[N];人民日報(bào);2009年

2 記者 劉霞;英用胚胎干細(xì)胞制造出紅血球[N];科技日報(bào);2010年

3 孫國根;復(fù)旦大學(xué)成功提取首個(gè)大鼠胚胎干細(xì)胞[N];中國醫(yī)藥報(bào);2009年

4 本報(bào)首席記者 任荃;第二顆“全能種子”會(huì)不會(huì)搶先“發(fā)芽”[N];文匯報(bào);2009年

5 劉霞;美用胚胎干細(xì)胞制造出血小板[N];科技日報(bào);2011年

6 記者 鄭曉春;科學(xué)家發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞分化機(jī)制[N];科技日報(bào);2008年

7 馮衛(wèi)東;拔一根頭發(fā),治療你的頑癥[N];科技日報(bào);2009年

8 首席記者 任荃;皮膚細(xì)胞“育”出三代活小鼠[N];文匯報(bào);2009年

9 本報(bào)記者 甘勃;“小小”鼠邁出了一大步[N];大眾科技報(bào);2009年

10 記者 李大慶;“小小”入選《時(shí)代周刊》2009年十大醫(yī)學(xué)突破[N];科技日報(bào);2009年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 蘇中淵;胚胎干細(xì)胞來源的間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢及胚胎干細(xì)胞表面分子的研究[D];浙江大學(xué);2010年

2 譚舟;MK和GM-CSFRα在胚胎干細(xì)胞中的表達(dá)與功能研究[D];浙江大學(xué);2010年

3 諶兵來;小鼠胚胎干細(xì)胞建系新方法及TFAG促進(jìn)鼠胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的初步研究[D];中南大學(xué);2003年

4 馬嵐;獼猴胚胎干細(xì)胞的分離、鑒定、培養(yǎng)及應(yīng)用研究[D];中國科學(xué)院研究生院（昆明動(dòng)物研究所）;2002年

5 趙云山;工程化心肌組織培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2005年

6 朱敏潔;人參皂甙Rg1誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞和在胚胎干細(xì)胞遷移中的作用[D];華中科技大學(xué);2008年

7 張佳蓉;小鼠胚胎干細(xì)胞表面蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];浙江大學(xué);2010年

8 廖宏慶;人類不同原核數(shù)目受精卵中篩選正常優(yōu)質(zhì)胚胎的策略研究[D];中南大學(xué);2010年

9 白春玲;牛孤雌多倍體胚胎與克隆多倍體胚胎的研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2011年

10 曲文玉;人胚胎干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及建系[D];中國醫(yī)科大學(xué);2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 李專;小鼠體節(jié)期胚胎：定向造血的發(fā)育動(dòng)力學(xué)研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2010年

2 呂建輝;小鼠新基因Jhdm1d的印記鑒定和表達(dá)譜分析[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2011年

3 孔凡濤;小鼠Klhdc10基因的表達(dá)與胚胎發(fā)育關(guān)系的研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2011年

4 韓曉芳;MEF和hLEF對小鼠ES細(xì)胞支持作用的比較性研究[D];華中科技大學(xué);2009年

5 蔡斌;體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞為神經(jīng)細(xì)胞模型的建立及相關(guān)因子的實(shí)驗(yàn)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2001年

6 呂一帆;胚胎干細(xì)胞在內(nèi)膜損傷小鼠宮腔內(nèi)移植的實(shí)驗(yàn)研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2010年

7 顧文佳;誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2004年

8 曲智;大鼠氣管粘膜上皮細(xì)胞損傷修復(fù)過程中胚胎干細(xì)胞相關(guān)基因OCT3/4的表達(dá)及其意義[D];中國醫(yī)科大學(xué);2010年

9 張波;8-細(xì)胞期胚胎注射檢測小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的全能性[D];河南大學(xué);2012年

10 孫國杰;山羊類胚胎干細(xì)胞的分離、克隆[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

，

本文編號：1713758