本文選題：單純皰疹病毒　切入點(diǎn)：糖蛋白B　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 人類單純皰疹病毒(Herpes simplex virus, HSV)感染在全世界都非常普遍,并且在生命的任何階段都可能發(fā)生。HSV I型感染主要引起生殖器以外的皮膚、粘膜(口腔粘膜)和器官(腦)的感染。HSV II型感染主要引起生殖器部位皮膚粘膜感染。HSV感染人體發(fā)病率高,復(fù)發(fā)率也高,對(duì)人體危害嚴(yán)重,可導(dǎo)致不孕、新生兒死亡�，F(xiàn)有的抗病毒藥物并不能有效的預(yù)防HSV原發(fā)感染、已經(jīng)建立的潛伏感染及復(fù)發(fā)性感染。因此,研制和接種安全有效的HSV疫苗是預(yù)防該病毒的理想方法。 HSV包膜糖蛋白在病毒的感染過程中起重要作用,介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合及融合,刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答,在疫苗研制中具有重要地位。其中g(shù)B蛋白和gD蛋白在HSV病毒表面數(shù)量較多,在病毒的吸附、穿膜、復(fù)制等過程中起到不可缺少的關(guān)鍵作用,且具有重要的抗原表位,是宿主細(xì)胞進(jìn)行體液免疫和細(xì)胞免疫的主要靶標(biāo)。因此,糖蛋白gB和gD是理想的HSV候選疫苗抗原。本研究分析篩選HSV I gB、HSV I gD、HSV II gD三種糖蛋白的胞外區(qū)片段抗原表位富集區(qū),利用基因工程技術(shù)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分別表達(dá)三種重組糖蛋白,檢測(cè)其生物學(xué)活性,為研制重組HSV I型及II型二價(jià)疫苗奠定基礎(chǔ)。 通過對(duì)HSV I gB、HSV I gD、HSV II gD三種糖蛋白的抗原表位分析,篩選三種糖蛋白含強(qiáng)抗原表位的較集中的胞外區(qū)片段,選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子,優(yōu)化設(shè)計(jì)基因的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu),化學(xué)合成了全新的HSV I gB(gB1)、HSV I gD(gD1)、HSV II gD(gD2)基因序列。將合成的基因片段插入真核表達(dá)載體pCEP4內(nèi),獲得的重組質(zhì)粒對(duì)CHO細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,Western blotting檢測(cè)培養(yǎng)基上清中表達(dá)產(chǎn)物。利用親和層析方法純化細(xì)胞培養(yǎng)上清。競(jìng)爭(zhēng)法ELISA測(cè)純化蛋白濃度,直接ELISA法檢測(cè)其抗原性。將純化的三種重組糖蛋白,間接ELISA法測(cè)血清特異性抗體效價(jià)以檢測(cè)其免疫原性。制備的三種抗gB1、抗gD1、抗gD2抗血清用體外中和試驗(yàn)檢測(cè)抗體阻斷HSV病毒感染宿主細(xì)胞的能力。與此同時(shí),將三種重組質(zhì)粒pCEP4 gB1、pCEP4 gD1、pCEP4 gD2對(duì)CHO細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,對(duì)抗生素篩選得到的含重組質(zhì)粒的細(xì)胞進(jìn)行單克隆培養(yǎng),Dot blotting篩選高表達(dá)三種糖蛋白的細(xì)胞株。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,重組糖蛋白gB1、gD1、gD2在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以可溶形式表達(dá),糖基化均一,分子量分別為85kDa、46kDa、46kDa。利用親和層析技術(shù)純化獲得了高純度的三種重組蛋白,SDS-PAGE及Weatern blotting檢測(cè)均顯示單一條蛋白帶。直接ELISA檢測(cè)顯示三種重組糖蛋白具有較好的抗原性和特異性。間接ELISA檢測(cè)免疫小鼠抗血清中三種抗體效價(jià)均≥1:5000,表明重組糖蛋白gB1、gD1、gD2有良好的免疫原性。在固定病毒 稀釋血清的中和試驗(yàn)中,抗血清樣品在1:68稀釋度下對(duì)HSV I型致Vero細(xì)胞病變有抑制作用,在1:20稀釋度下對(duì)HSV II型致Vero細(xì)胞病變有抑制作用。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后,Dot blotting檢測(cè)篩選出兩株高表達(dá)gB1重組糖蛋白的細(xì)胞株CHO/pCEP4 gB1 1C12和CHO/pCEP4 gB1 1F7 ;兩株高表達(dá)gD1重組糖蛋白的細(xì)胞株CHO/pCEP4 gD1 C2和CHO/pCEP4 gD1 D3;兩株高表達(dá)gD2重組糖蛋白的細(xì)胞株CHO/pCEP4 gD2 E1和CHO/pCEP4 gD2 G4。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 孟祥俊;單純皰疹病毒糖蛋白的特性及其臨床意義[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).病毒學(xué)分冊(cè);2002年06期

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本文編號(hào)：1695414