本文選題：NrdH-redoxin　切入點：分枝桿菌　出處：《西南大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染病。全球近1／3的人口感染過結(jié)核菌。人們對結(jié)核病的致病菌——結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的生物特性進行廣泛研究,繼而研發(fā)了鏈霉素、異煙肼、利福平等治療性藥物,使得人類對結(jié)核病的控制取得了可喜的成績,遏制了結(jié)核病的蔓延和傳播。然而由于化學(xué)藥物的不合理應(yīng)用、艾滋病與結(jié)核病聯(lián)合感染、人口流動的增加以及耐藥結(jié)核病菌的流行,使得近年來結(jié)核病疫情下降緩慢,在部分地區(qū)甚至有所回升。當(dāng)前,在結(jié)核病控制工作中急需開發(fā)出有效的預(yù)防性、治療性疫苗和新型藥物。尋找新的結(jié)核藥物作用靶點和開發(fā)新型抗結(jié)核藥物已成為當(dāng)前最為關(guān)注的熱點。 結(jié)核分枝桿菌是一種胞內(nèi)致病菌,主要存在于單核吞噬細胞內(nèi)。單核吞噬細胞產(chǎn)生的ROS (reactive oxygen species)具有強的抗菌活性。因此,當(dāng)單核吞噬細胞出于防御病菌產(chǎn)生活性基團時,結(jié)核分枝桿菌能夠發(fā)動一個抗氧化的防御系統(tǒng)來清除氧化活性基團,以適應(yīng)宿主巨噬細胞高度氧化型的環(huán)境,并在其中持留和繁殖。結(jié)核分枝桿菌具有一系列的氧化還原蛋白來維持細胞內(nèi)最適的氧化還原內(nèi)環(huán)境,從而抑制脂質(zhì)的過氧化、DNA交聯(lián)和抵抗巨噬細胞的氧化攻擊等。目前的研究表明這些蛋白包括硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)、過氧化物還原酶(peroxiredoxin,Prx)、烷基過氧化氫還原酶(alkyl hydroperoxide reductase, Ahp)等。此外,結(jié)核分枝桿菌中還存在著另一種含有CXXC活性位點基序的蛋白——NrdH-redoxin,該蛋白屬于硫氧還蛋白超家族,目前關(guān)于該蛋白的研究較少,其在細胞內(nèi)的生理功能仍有待揭示。因此,開展對該蛋白的功能和性質(zhì)的研究,有助于進一步了解結(jié)核分枝桿菌胞內(nèi)氧化還原電勢的調(diào)控及其應(yīng)對氧化應(yīng)激的防御機制。 本研究主要是對結(jié)核分枝桿菌H37Rv的NrdH-redoxin基因nrdH (Rv3053c)的克隆、表達及活性研究,并通過生物信息學(xué)對該基因編碼蛋白進行結(jié)構(gòu)和功能的分析及預(yù)測。從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得結(jié)核分枝桿菌H37Rv的NrdH-redoxin基因nrdH的核苷酸序列,設(shè)計一對引物,以結(jié)核分枝桿菌H37Rv全基因組為模板,體外擴增獲得nrdH基因。通過TA克隆,將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple Vector,然后亞克隆至載體pET28a(+)中,經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒酶切以及序列測定證明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET2S-nrdH。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)BL21 (DE3),以溫度、時間和IPTG濃度建立三因素三水平的正交實驗,對該重組蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達條件進行優(yōu)化。使用最佳表達條件進行擴大培養(yǎng),采用Ni+凝膠親和層析方法純化獲得高純度的重組NrdH-redoxin。純化蛋白的氧化還原活性通過二硫蘇糖醇還原牛胰島素的反應(yīng)得到證實。我們研究了過表達該酶對宿主菌的影響,包括過表達NrdH-redoxin對宿主菌生長的影響以及過表達NrdH-redoxin的宿主菌對抗氧化壓力的耐受性研究。 運用Vector NTI 9, SignalP, swiss model等生物信息學(xué)資源對NrdH-redoxin的基本性質(zhì)進行了分析,包括對蛋白一級結(jié)構(gòu)(親水性／疏水性,跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽等)；二級結(jié)構(gòu)以及三級結(jié)構(gòu)等基本性質(zhì)的預(yù)測分析。結(jié)果表明：結(jié)核分枝桿菌H37Rv NrdH-redoxin無信號肽,不存在跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)；二級結(jié)構(gòu)是由3個α螺旋及4個β折疊片等構(gòu)成。同時在一、二級結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上,利用同源建模的方法完成了其三維結(jié)構(gòu)的建模。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)庫中搜尋模板,發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌H37RvNrdH-redoxin的1-72位氨基酸殘基肽段與產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)的NrdH-redoxin (PDB登陸號為1r7hA)的序列一致性高達73.611%。利用比較基因組學(xué)分析該蛋白在分枝桿菌屬中的同源和分布情況,結(jié)果顯示結(jié)核分枝桿菌H37Rv NrdH-redoxin同已報道的其他分枝桿菌屬來源的NrdH-redoxin有較高的同源性。NrdH-redoxin的三種特征序列基序在這些物種中都存在,除了三株能降解多環(huán)芳烴的分枝桿菌(包括Mycobacterium sp. MCS, Mycobacterium sp. KMS和Mycobacterium sp. JLS)以外,其它分枝桿菌中的序列是高度一致的。進一步分析發(fā)現(xiàn)不同分枝桿菌的nrdH基因組合方式也較為保守,nrdH、nrdI和nrdE三個基因緊密相連,很可能是共轉(zhuǎn)錄的；在編碼核苷酸還原酶(ribonucleotide reductase,RNR)α亞基的nrdE基因和編碼核苷酸還原酶β亞基的nrdF基因中間還有兩個ORF,主要是假定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子和單加氧酶。在非致病的分枝桿菌中,nrdH基因的組合方式更為保守,在nrdHIE基因上游普遍存在一個NADPH依賴型的黃素單核苷酸還原酶。但在致病的分枝桿菌中,在nrdH周圍的上下游基因中大部分是編碼一些功能未知的蛋白,所以其功能也有待進一步研究。綜上,本研究為揭示結(jié)核分枝桿菌NrdH-redoxin的生理功能及其抗氧化應(yīng)激機制,并以其作為候選藥物靶標(biāo),篩選其抑制劑奠定了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R378

【參考文獻】

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本文編號：1695460