本文選題：人巨細胞病毒　切入點：逆轉(zhuǎn)錄病毒　出處：《暨南大學》2010年碩士論文

【摘要】：目的：pUL23和pUL49分別是人巨細胞病毒(human cytomegalo virus HCMV) UL23、UL49基因編碼的蛋白。UL23是病毒生長的非必須基因,其表達產(chǎn)物pUL23是病毒皮層蛋白。UL49是病毒的必須基因,其表達產(chǎn)物pUL49也是是病毒皮層蛋白,兩種病毒蛋白的功能還不清楚。通常病毒感染宿主細胞之后,其自身編碼的蛋白通過與宿主蛋白或病毒蛋白自身蛋白相互作用,影響病毒生長、繁殖及致病過程。因此,大部分病毒蛋白發(fā)揮功能的場所是宿主細胞。建立穩(wěn)定表達HCMV pUL23和pUL49哺乳動物細胞系,將為研究pUL23和pUL49與宿主細胞蛋白的相互作用,及其在病毒生活周期中的作用提供有利工具。 人包皮成纖維細胞(human primary foreskin fibroblasts HFF)和人胚肺成纖維細胞(human embryonic lung fibroblasts HELF)是能夠在體外感染HCMV的宿主細胞,原代的細胞病毒感染較好,因此,一般采用原代培養(yǎng)細胞作為HCMV的感染模型。 本課題對在原代培養(yǎng)的哺乳動物細胞中建立穩(wěn)定表達外源蛋白細胞系的方法進行了深入探討。 方法： 1.穩(wěn)定表達HCMV pUL23和pUL49哺乳動物細胞系的建立方法 1)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法 ①構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLEGFP-N1-UL23-FLAG、pLEGFP-N 1-UL49-MYC; ②包裝含有pLEGFP-N1-UL23-FLAG、pLEGFP-Nl-UL49-MYC、pLEGFP-N1的逆轉(zhuǎn)錄病毒,并感染HFF、HELF細胞； ③分別用100ug/ml、700ug/ml濃度的G418篩選穩(wěn)定表達pLEGFP-N1-UL23-FLAG. pLEGFP-N1-UL49-MYC、pLEGFP-N1的HFF、HELF細胞。 2)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法 ①建真核表達載體pCDNA3.1 (+)-UL23-FLAG; ②質(zhì)體轉(zhuǎn)染pCDNA3.1 (+)-UL23-FLAG、pCDNA3.1(+)進入HELA細胞； ③用1200ug/ml濃度的G418篩選穩(wěn)定表達pCDNA3.1 (+)-UL23-FLAG、pCDNA3.1(+)的HELA細胞。 2..穩(wěn)定表達HCMV pUL23和pUL49哺乳動物細胞系的鑒定 1)RT-PCR鑒定病毒蛋白pUL23、pUL49的表達提取穩(wěn)定細胞系的RNA,做RT-PCR鑒定,電泳觀察結(jié)果； 2) Western-blotting鑒定病毒蛋白pUL23、pUL49的表達提取穩(wěn)定細胞系的蛋白質(zhì),用特異性抗體檢測； 3)免疫熒光技術(shù)胞內(nèi)鑒定病毒蛋白pUL23、pUL49的表達在穩(wěn)定細胞系胞內(nèi),用特異性的抗體能夠檢測pUL23、pUL49的表達。 3.病毒在HFF穩(wěn)定細胞系中生長動力學的檢測 1) Towne病毒株能否感染穩(wěn)定表達pUL23、pUL49 HFF細胞系的檢測； 2) Towne病毒株在穩(wěn)定表達pUL23、pUL49 HFF細胞系中的多步生長曲線。 結(jié)果： 1)經(jīng)雙酶切、PCR以及測序鑒定證明逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLEGFP-N 1-UL23-FL AG、pLEGFP-N1-UL49-MYC和真核表達載體pCDNA3.1(+)-UL23-FLAG構(gòu)建成功； 2)通過觀察逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLEGFP-N1包裝出的逆轉(zhuǎn)錄病毒,感染HFF、HELF細胞后可見的綠色熒光,表明逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝成功； 3)通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定細胞系能夠在RNA水平上表達目的基因； 4) Western-blotting檢測發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定細胞系能夠在蛋白水平上表達目的基因； 5)免疫熒光技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定細胞系胞內(nèi)能夠表達pUL23、pUL49,且pUL23的胞內(nèi)定位于文獻報道相符合。 6)HFF穩(wěn)定細胞系中Towne的生長動力學與原代HFF細胞沒有明顯差異。 結(jié)論：本文采用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法克服HFF、HELF原代培養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)染難的狀況,成功地構(gòu)建了穩(wěn)定表達pUL23和pUL49的HFF、HELF細胞系；在RNA水平和蛋白質(zhì)水平都檢測到pUL23和pUL49的表達,并在穩(wěn)定細胞系觀察到pUL23定位在細胞質(zhì),pUL49主要定位在細胞核,pUL23與文獻報道的定位一致,HFF穩(wěn)定細胞系中Towne的感染和復制水平與原代HFF細胞沒有明顯差異。因此,本研究中獲得的穩(wěn)定表達pUL23和pUL49 HFF和HELF細胞系可以作為研究病毒蛋白pUL23和pUL49的工具。
[Abstract]:Objective: pUL23 and pUL49 are the human cytomegalovirus (human cytomegalo virus HCMV UL23), UL49 gene encoding protein.UL23 is a non essential gene for virus growth, the expression product of pUL23 virus tegument protein.UL49 gene virus is a must, the expression product of pUL49 virus is cortactin, two kinds of virus protein function not clear. Usually after virus infection of host cells, its encoding protein with host proteins or virus protein protein interactions, influence virus growth, reproduction and pathogenesis. Therefore, most of the virus protein function is the place of the host cell. The establishment of stable HCMV pUL23 and pUL49 expression in mammalian cell lines, for each other the effects of pUL23 and pUL49 with host cell proteins, and their role in the virus life cycle to provide a favorable tool.
Human foreskin fibroblasts (human primary foreskin fibroblasts HFF) and human embryonic lung fibroblast cells (human embryonic lung fibroblasts HELF) is able to in vitro HCMV infected host cells, better infection of primary cell virus so commonly used cells in primary culture as the infection model of HCMV.
In this study, the method of stable expression of foreign protein cell lines in primary cultured mammalian cells was discussed.
Method錛，

本文編號：1695358