本文選題：脊髓損傷　切入點(diǎn)：骨髓間質(zhì)干細(xì)胞　出處：《中南大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】： 目的:1.大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)特性,探討MSCs的體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增的規(guī)律和特點(diǎn)。建立SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。2.采用β-硫基乙醇(β-ME)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)作為誘導(dǎo)劑,對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)進(jìn)行體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。探討β-ME和bFGF體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化神經(jīng)元細(xì)胞的機(jī)制,為脊髓損傷的細(xì)胞移植治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法:1.大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增及鑒定 1.1原代培養(yǎng) 取一月齡SD大鼠股骨和脛骨,采用全骨髓培養(yǎng)法,以L-DMEM完全培養(yǎng)基沖出骨髓過(guò)濾后直接接種于培養(yǎng)瓶中,3天后首次換液,以后每3天換液一次。至細(xì)胞融合達(dá)80%以上時(shí),進(jìn)行傳代。 1.2大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增的研究 取第1、4、7、10、13代細(xì)胞,觀察其細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及貼壁率。 1.3大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志的鑒定 取第4代細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 2.rBMSC體外誘導(dǎo)分化 2.1 rBMSC向神經(jīng)元細(xì)胞誘導(dǎo)分化 取P4代的rBMSC,以2×10~4/ml濃度接種于24孔板內(nèi),待細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合時(shí),分別加入β-硫基乙醇(β-ME)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF),倒置相差顯微鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞形態(tài)變化。 2.2細(xì)胞免疫熒光鑒定 采用細(xì)胞免疫熒光方法,對(duì)以上兩組細(xì)胞誘導(dǎo)后5h后檢測(cè)神經(jīng)元標(biāo)志物TuJ1和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP的表達(dá)情況,熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。 2.3 rBMSC誘導(dǎo)為神經(jīng)元細(xì)胞陽(yáng)性率比較 熒光顯微鏡下在各組細(xì)胞隨機(jī)取300個(gè)細(xì)胞,計(jì)數(shù)TuJ1反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù),檢驗(yàn)各組不同時(shí)間點(diǎn)的差異,以及每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組間的差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)均以x±s表示,并用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。 2.4免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)分化細(xì)胞的特異性標(biāo)志物 分別取誘導(dǎo)分化后0h,1h,5h后的細(xì)胞,使用2X SDS samplebuffer裂解細(xì)胞,進(jìn)行神經(jīng)元特異性蛋白TuJ-1和星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白GFAP的定量分析。 結(jié)果:1.貼壁篩選法,通過(guò)多次換液可以分離、純化BMSC,該法簡(jiǎn)單、方便、效果好。2.BMSC在體外培養(yǎng)中有很強(qiáng)的增殖能力,10代以前的細(xì)胞形態(tài)較一致,增殖能力強(qiáng),隨傳代次數(shù)的增加,增殖能力減弱,形態(tài)發(fā)生不規(guī)則變化。細(xì)胞生長(zhǎng)的第1、4、7、10、13代的貼壁率變化規(guī)律基本相同,無(wú)顯著區(qū)別。傳代后細(xì)胞貼壁率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增高。3.rBMSC的表面標(biāo)志抗原呈現(xiàn)多樣性的特征,rBMSC不表達(dá)造血細(xì)胞表面抗原CD34、CD45,說(shuō)明rBMSC非造血類(lèi)細(xì)胞;而其表達(dá)CD90、CD44,說(shuō)明rBMSC的表面標(biāo)志具有非單一性的特性。它表達(dá)了間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞的表面標(biāo)志。4.第4代rBMSC加入誘導(dǎo)劑后可分化為神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞�？梢�(jiàn)光下觀察:前者細(xì)胞體積較小數(shù)量較少,常有數(shù)個(gè)短小突起和一個(gè)較長(zhǎng)的突起,呈典型的雙極、多極或錐形,具有較強(qiáng)的折光性;后者細(xì)胞體積較大,細(xì)胞突起較多且粗,有些形態(tài)呈星狀,有許多突起呈放射狀伸出,平鋪在培養(yǎng)皿上。5.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果示細(xì)胞誘導(dǎo)后5h,部分細(xì)胞TuJ1反應(yīng)陽(yáng)性,為神經(jīng)元細(xì)胞;部分細(xì)胞GFAP反應(yīng)陽(yáng)性,為星形膠質(zhì)細(xì)胞。6.rBMSC誘導(dǎo)為神經(jīng)元細(xì)胞陽(yáng)性率比較,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,誘導(dǎo)后β-ME組1h,5h分化率最高,24h bFGF組分化率最高,與其它組有顯著差異(P＜0.01);β-ME組在誘導(dǎo)24h后多數(shù)細(xì)胞已死亡,無(wú)法統(tǒng)計(jì)。β-ME組1h與5h的分化率有顯著差異(P＜0.01);bFGF組5h和24h的分化率與1h的分化率有顯著差異(P＜0.01),但5h和24h的分化率無(wú)顯著差異(P＞0.05)。7.Western Blotting檢測(cè)結(jié)果顯示,在上樣20ug總蛋白,隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),rBMSC誘導(dǎo)分化后,表達(dá)TUJ-1和GFAP的量明顯增加。并且,隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量增多。 結(jié)論:1.本實(shí)驗(yàn)采用骨髓直接培養(yǎng)法來(lái)分離培養(yǎng)BMSC,方法簡(jiǎn)單,效果亦可靠,通過(guò)數(shù)代的傳代擴(kuò)增就能獲得高純度、高數(shù)量的rBMSC,以滿(mǎn)足組織工程實(shí)驗(yàn)研究的需要。2.采用β-硫基乙醇(β-ME)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)作為誘導(dǎo)劑,體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)可分化為神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。
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本文編號(hào)：1669794