本文選題：金黃色葡萄球菌　切入點(diǎn)：疫苗　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2010年碩士論文

【摘要】： 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種重要的革蘭氏陽性條件致病菌,為人畜共患病原菌,可引起多種嚴(yán)重感染。感染金黃色葡萄球菌,通常依賴抗生素治療,但由于抗生素的濫用,出現(xiàn)多種耐受抗生素的新菌株,研究表明40%-60%的臨床分離株對多種抗生素具有抗性,特別是耐甲氧西林菌株的迅速蔓延使得單純依靠抗生素治療金黃色葡萄球菌引發(fā)的相關(guān)疾病變得越來越不可靠,金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌)疫苗是預(yù)防感染的有效手段,可緩解抗生素應(yīng)用所致的選擇性壓力,大大延緩耐藥菌的產(chǎn)生,且與抗生素協(xié)同作用,有望解決金葡菌感染這一棘手問題。金黃色葡萄球菌疫苗的研究具有重要的軍事意義和民用價值。因燒傷、槍傷而使感染幾率增高的士兵、消防人員、警務(wù)人員等,接種金黃色葡萄球菌疫苗可極大的減少因嚴(yán)重感染而引發(fā)的死亡。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),全球因慢性腎功能衰竭而需要進(jìn)行透析的病人已達(dá)200余萬,北京、上海兩大城市中,每年新增透析患者的人數(shù)均在4000例左右,這一人群透析過程中感染金葡菌的幾率非常高。國內(nèi)一項(xiàng)研究結(jié)果表明,燒傷面積大于30%者,40%并發(fā)金黃色葡萄球菌引起的膿毒癥,其中20%的患者最終轉(zhuǎn)為多器官功能障礙綜合癥,50%以上死亡。另據(jù)報(bào)道75%的早產(chǎn)兒膿毒癥是由金黃色葡萄球菌引起的。對這些人群接種金黃色葡萄球菌疫苗將極大的改善其生存質(zhì)量,降低并發(fā)癥的發(fā)生率和死亡率。 Watson等曾用滅活的金黃色葡萄球菌制作疫苗,但由于該疫苗為全菌疫苗,除保護(hù)性抗原外,還有許多不相關(guān)和有毒的成分,毒副反應(yīng)較大,臨床應(yīng)用受限。另外,金黃色葡萄球菌感染宿主后,盡管宿主相應(yīng)抗體水平顯著升高,但有抗體存在的宿主還是會被感染,顯然,這些抗體不能起到有效的保護(hù)作用,因而要得到能激發(fā)保護(hù)性抗體的疫苗必須尋找其他抗原。金葡菌不像其它大多數(shù)致病菌那樣有一個或幾個主要的致病因子,這就使得金葡菌疫苗的研究困難重重。國內(nèi)外專家學(xué)者在這方面做了許多卓有成效的工作,找到多種與金黃色葡萄球菌致病力相關(guān)的因子,如毒素、莢膜、胞外基質(zhì)結(jié)合蛋白、表面蛋白、毒力因子表達(dá)調(diào)控蛋白等,并就這些分子作為新一代抗金黃色葡萄球菌疫苗的有效成分作了深入研究。要設(shè)計(jì)一種有效的金黃色葡萄球菌疫苗仍存在許多障礙,因?yàn)榻鹌暇玖σ蜃颖姸?如:粘連素,胞外酶,外毒素),金葡菌調(diào)控這些因子的路徑復(fù)雜。動物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示:多組分的金葡菌疫苗對控制金葡菌感染可能具有較好的前景。 本研究即根據(jù)國內(nèi)外的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道選取20種與金黃色葡萄球菌毒性相關(guān)的蛋白,包括毒素:溶血素(孔形的溶血性的外蛋白)、自溶素、殺白細(xì)胞素、腸毒素,膠原結(jié)合蛋白,粘附因子,纖維結(jié)合素結(jié)合蛋白,葡萄球菌A蛋白,絲氨酸-天冬氨酸序列重復(fù)蛋白及其他與金葡菌毒性相關(guān)的表面蛋白。對它們是否能保護(hù)機(jī)體對抗金葡菌感染進(jìn)行一系列研究,旨在篩選出具有顯著保護(hù)效果的金黃色葡萄球菌蛋白,制備多組分疫苗預(yù)防、治療各類金黃色葡萄球菌引發(fā)的感染。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括兩個部分:一.金黃色葡萄球菌候選保護(hù)性抗原的表達(dá)、純化。以金黃色葡萄球菌USA300、12598基因組DNA作為模板,根據(jù)GenBank中各種蛋白的基因序列設(shè)計(jì)引物,以PCR方法擴(kuò)增目的基因,將其克隆入pET-21a(㧏),DNA測序鑒定結(jié)果表明,編碼的氨基酸序列與預(yù)期一致。獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)后目的蛋白得以高效表達(dá),經(jīng)分析表達(dá)蛋白分子量與預(yù)期基本一致。我們根據(jù)各蛋白的等電點(diǎn)用SP Sepharose F.F柱或Q Sepharose F.F.柱進(jìn)行第一步純化,又根據(jù)目的蛋白羧基端帶有His標(biāo)簽,用鎳柱進(jìn)一步純化,最終得到純度較高的蛋白,并對純化蛋白進(jìn)行定量。二.候選保護(hù)性抗原免疫保護(hù)性分析。分別以菌株USA300、12598、546、1885基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增目的基因。菌體USA300、546、1885分別免疫小鼠后,收集血清,通過點(diǎn)雜交篩選目的蛋白,結(jié)合上述PCR結(jié)果初步確定各基因在這幾株菌中的分布情況。為了研究候選是否具有廣譜抗金黃色葡萄球菌感染的效果,本研究通過免疫學(xué)方法檢測候選的保護(hù)效果。首先測定菌株USA300的LD50,另一方面選取目的蛋白ClfA、FnbA、FnbB、SasF與鋁佐劑混合免疫BALB/c小鼠,收集免疫血清,測定抗體滴度。第三次免疫一周后,用菌株USA300的一個LD50攻擊免疫后的小鼠,觀察小鼠存活情況。 目前已得到20種目的蛋白的表達(dá)純化產(chǎn)物,并對其進(jìn)行定量。根據(jù)點(diǎn)雜交與PCR結(jié)果,我們選取ClfA、FnbA、FnbB、SasF這四種蛋白進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn),檢測其抗金黃色葡萄球菌感染的效果。攻毒后小鼠存活情況顯示這四種蛋白均無明顯免疫保護(hù)效果,恐難以作為金葡菌疫苗的有效組分。
[Abstract]:Staphylococcus aureus ( Staphylococcus aureus ) is an important Gram - positive condition pathogenic bacteria . It is a kind of pathogenic bacterium for human and livestock , which can cause multiple serious infections . It is an effective means to prevent infection .


A vaccine against Staphylococcus aureus has been prepared by Watson et al . , but because the vaccine is a full - bacterial vaccine , there are many unrelated and toxic components besides the protective antigen .


In this study , 20 kinds of protein related to S . aureus toxicity were selected according to relevant literatures at home and abroad , including toxin : Hemolysin ( pore - shaped exoprotein ) , autolysin , cytolysin , enterotoxins , collagen - binding protein , adhesion factor , fibronectin binding protein , staphylococcus A protein , serine - aspartic acid sequence repeat protein and other surface proteins related to the toxicity of Staphylococcus aureus .


coli BL21 ( DE3 ) . The recombinant plasmid was cloned into pET - 21a ( ? ) .


At present , the expression and purification products of 20 kinds of proteins have been obtained and quantified . According to the results of dot blot and PCR , we select the four proteins of ClA , FnbA , FnbB and SasF to test their anti - Staphylococcus aureus infection . The survival of mice after challenge shows that these four proteins have no obvious immune protective effect , and they may be difficult to be used as an effective component of Staphylococcus aureus vaccine .

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張曉艷;易紹瓊;陳薇;;金黃色葡萄球菌疫苗的研究進(jìn)展[J];微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展;2009年02期

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本文編號：1669783