本文選題：Bcl-2　切入點(diǎn)：Fas抗體/Jo2　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2009年博士論文

【摘要】： 肝臟是最早進(jìn)行細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)的器官之一。人肝細(xì)胞移植不僅可作為治療肝衰竭和多種代謝性疾病的有效手段,而且將人肝細(xì)胞移植到動(dòng)物體內(nèi),形成"嵌合肝",甚至在動(dòng)物體內(nèi)重建人類肝組織,以期獲得可感染肝炎病毒的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,成為當(dāng)前研究的一個(gè)重要方向。 要想建立理想的人鼠嵌合肝動(dòng)物模型,使人肝細(xì)胞在小鼠體內(nèi)長時(shí)間存活并保持功能,就必須滿足外源肝細(xì)胞移植到動(dòng)物體內(nèi)定植的基本條件:一是對(duì)外源肝細(xì)胞無免疫排斥;二是宿主肝細(xì)胞形成再生需求和環(huán)境;三是移植肝細(xì)胞較宿主肝細(xì)胞更具增殖優(yōu)勢(shì)。 為了尋找不僅能使小鼠肝損傷,形成再生需求和環(huán)境,同時(shí)又賦予移植細(xì)胞更強(qiáng)生長優(yōu)勢(shì)的方法。我們?cè)O(shè)想,利用Fas抗體誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞進(jìn)入可控的凋亡狀態(tài),移植轉(zhuǎn)Bcl-2基因的人肝細(xì)胞具有的抗凋亡能力使其在鼠肝內(nèi)具有更強(qiáng)的增殖優(yōu)勢(shì),來促進(jìn)人肝細(xì)胞在嵌合鼠體內(nèi)增殖。 Fas是一種細(xì)胞表面信號(hào)分子,屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員。當(dāng)與Fas配體或特異性抗體(如Jo2 mAb)結(jié)合后,Fas啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。Bcl-2是一種細(xì)胞漿蛋白,它屬于常生長蛋白質(zhì)家族(ever-growing family of protein)中的一員。該家族在細(xì)胞凋亡中起著主導(dǎo)作用。研究證明,小鼠肝細(xì)胞對(duì)Jo2 mAb所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡非常敏感,給小鼠反復(fù)注射小劑量的Jo2 mAb不會(huì)引起肝外組織器官明顯損傷,卻可造成肝細(xì)胞大面積的凋亡,引起動(dòng)物出現(xiàn)暴發(fā)性肝衰竭癥狀和死亡。而表達(dá)Bcl-2的轉(zhuǎn)基因肝細(xì)胞可完全阻止由Jo2mAb引起的肝細(xì)胞凋亡。 HepaRG細(xì)胞是從慢性丙型肝炎感染的肝癌患者體內(nèi)非瘤組織分離而得的細(xì)胞株,在廣義上屬于永生化細(xì)胞株的范疇。HepaRG細(xì)胞與正常的肝細(xì)胞相比,具有相似的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)功能;作為潛能祖細(xì)胞,具有向肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞雙向分化的潛能。細(xì)胞培養(yǎng)顯示,HepaRG細(xì)胞在分化過程中,能持續(xù)表達(dá)藥物代謝酶(I項(xiàng)藥代酶P450和Ⅱ項(xiàng)藥代酶)達(dá)6w之久;體內(nèi)移植表明,HepaRG細(xì)胞對(duì)裸鼠未顯示明顯的致瘤性,在Alb-uPA/SCID小鼠體內(nèi),保持了分化功能,并具有成熟肝細(xì)胞的生物學(xué)特性,說明HepaRG可作為藥物代謝研究和細(xì)胞移植的良好的體內(nèi)外模型。 本研究將基于Bcl-2抗凋亡特性,以轉(zhuǎn)染了Bcl-2基因的HepaRG細(xì)胞為移植細(xì)胞,聯(lián)合Fas抗體誘導(dǎo)SCID小鼠肝細(xì)胞凋亡來構(gòu)建人鼠嵌合肝動(dòng)物模型。因?yàn)镴o2 mAb可誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞的凋亡,給外源性肝細(xì)胞生長讓出“空間”,提供了肝再生需求及環(huán)境,為移植的外源性肝細(xì)胞提供了增殖信號(hào)。同時(shí),表達(dá)Bcl-2轉(zhuǎn)基因的移植肝細(xì)胞能抵御Jo2 mAb引起的肝細(xì)胞凋亡,使移植肝細(xì)胞具有較鼠肝細(xì)胞更強(qiáng)的生長和生存優(yōu)勢(shì)。此外,選擇SCID小鼠作為移植受體可避免免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生,所以該策略很好地滿足了異種細(xì)胞移植的基本條件。 方法和結(jié)果 1.Jo2 mAb對(duì)體外小鼠肝細(xì)胞和HepaRG細(xì)胞培養(yǎng)的影響 體外培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞和HepaRG細(xì)胞,加入不同濃度的Jo2 mAb(終濃度為10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL),以了解Jo2 mAb作為誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞凋亡的手段,對(duì)移植的HepaRG細(xì)胞是否也有相同影響。 加入Jo2 mAb 5μg/mL于72h、10μg/mL于48h和72h對(duì)小鼠肝細(xì)胞有致凋亡征象,表現(xiàn)為細(xì)胞體積縮小、胞質(zhì)濃縮、胞核固定,細(xì)胞折光率明顯增加;瑞氏染色出現(xiàn)凋亡小體;MTT測(cè)定該三時(shí)相點(diǎn)細(xì)胞抑制率分別為52%、51%和67%,與空白對(duì)照組有顯著性差異P0.05㖞;小鼠肝細(xì)胞DNA出現(xiàn)明顯排列成梯狀的分子條帶,而ALT、AST以及LDH無明顯變化。對(duì)照HepaRG細(xì)胞不同濃度的Jo2 mAb作用未發(fā)現(xiàn)明顯的凋亡征象。 2.經(jīng)Jo2 mAb體內(nèi)誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞凋亡后的HepaRG細(xì)胞移植研究 采用Jo2 mAb腹腔注射,劑量為0.3mg/kg,誘導(dǎo)20只SCID小鼠制備急性肝損傷模型,24h內(nèi)按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分組方法,挑選小鼠經(jīng)脾移植2×106個(gè)HepaRG細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組(10只),未經(jīng)HepaRG細(xì)胞移植為對(duì)照組(10只)。 實(shí)驗(yàn)組小鼠有9只存活超過4w,而對(duì)照組小鼠3d內(nèi)先后死亡9只,實(shí)驗(yàn)組血清ALT和AST趨于正常,顯著低于對(duì)照組(P 0.01),且存活時(shí)間顯著高于對(duì)照組(P 0.01)。實(shí)驗(yàn)組經(jīng)HepaRG細(xì)胞移植后肝組織結(jié)構(gòu)完整,無明顯出血、壞死,而對(duì)照組肝組織結(jié)構(gòu)模糊,出血和大面積點(diǎn)、片狀壞死明顯。實(shí)驗(yàn)組移植后4w免疫組化可見人白蛋白、CK18、人Hep Par 1陽性表達(dá)細(xì)胞,肝組織免疫熒光可見人白蛋白陽性細(xì)胞的表達(dá),但表達(dá)數(shù)量較少。 3.可穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Bcl-2的HepaRG細(xì)胞株的建立 雖然Jo2 mAb對(duì)HepaRG細(xì)胞體外無致凋亡作用,但鑒于移植到小鼠體內(nèi)的HepaRG細(xì)胞盡管能存活,但不具有增殖優(yōu)勢(shì),經(jīng)Jo2 mAb啟動(dòng)細(xì)胞凋亡途徑,缺乏抗凋亡能力。為此,我們將pSFFV-neo Bcl-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepaRG細(xì)胞,經(jīng)過G418和抗Fas抗體篩選,獲得雙抗性克隆,從而建立穩(wěn)定表達(dá)Bcl-2蛋白的HepaRG細(xì)胞株。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Bcl-2蛋白的HepaRG細(xì)胞株,培養(yǎng)14d形態(tài)學(xué)無變化。免疫組化檢測(cè)到Bcl-2以及人白蛋白的表達(dá),采用RT-PCR法檢測(cè)到Bcl-2的mRNA以及Western blot法檢測(cè)到Bcl-2表達(dá)的蛋白,而對(duì)照未轉(zhuǎn)染Bcl-2的HepaRG細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的HepaRG細(xì)胞均未見Bcl-2的陽性表達(dá)。 4.Bcl-2/HepaRG細(xì)胞-鼠嵌合肝動(dòng)物模型的構(gòu)建 將2×106個(gè)Bcl-2轉(zhuǎn)基因HepaRG細(xì)胞經(jīng)脾移植到SCID小鼠體內(nèi),移植后1d始給予Jo2 mAb 0.2mg/Kg腹腔注射,1次/周,持續(xù)10周建立Bcl-2/HepaRG細(xì)胞-鼠嵌合模型(n=43);移植HepaRG細(xì)胞,同樣給予Jo2 mAb注射建立HepaRG細(xì)胞-鼠嵌合模型(n=25);移植HepaRG細(xì)胞,未腹腔注射Jo2 mAb的小鼠為對(duì)照組(n=14)。 三組小鼠均能存活至24w。Bcl-2/HepaRG細(xì)胞-鼠嵌合肝模型肝組織免疫組化和免疫熒光可見Bcl-2蛋白的表達(dá),且隨著移植時(shí)間的延長,從2w開始增加,16w表達(dá)最強(qiáng),此后逐漸衰減,至24w降到最低。 三組小鼠肝組織免疫組化都能檢測(cè)到人白蛋白和CK18的表達(dá),免疫熒光還可檢測(cè)到Ki67的表達(dá)。Bcl-2/HepaRG細(xì)胞-鼠嵌合肝人白蛋白、CK18以及Ki67陽性持續(xù)時(shí)間為2~24w,整體趨勢(shì)為隨著移植后時(shí)間推移,呈先升高后逐漸下降的過程,在移植后16w出現(xiàn)峰值,人肝細(xì)胞在嵌合鼠肝組織中的替代率約為22%;而HepaRG細(xì)胞-鼠嵌合肝上述三指標(biāo)陽性表達(dá)時(shí)間為2~20w,高峰時(shí)間為12w,替代率約為15%;對(duì)照組的表達(dá)時(shí)間就僅為2~12w,高峰時(shí)間8w,替代率僅為8%左右。此外,Bcl-2/HepaRG細(xì)胞-鼠嵌合肝4~24w、HepaRG細(xì)胞-鼠嵌合肝4~20w和對(duì)照組4~12w肝組織可通過RT-PCR檢測(cè)到人白蛋白mRNA的陽性條帶、Western Blot于血清中可檢測(cè)到人白蛋白,同時(shí)經(jīng)ELISA可定量檢測(cè)到血清中人白蛋白的含量。Bcl-2/HepaRG細(xì)胞-鼠嵌合肝模型人血清白蛋白高峰值為0.101μg/mL,出現(xiàn)在16w;而HepaRG細(xì)胞-鼠嵌合肝模型人血清白蛋白高峰值為0.042μg/mL,出現(xiàn)在12w;對(duì)照組人血清白蛋白高峰值為0.022μg/mL,出現(xiàn)在8w。 結(jié)論: 1.證實(shí)Jo2 mAb可體外誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞凋亡。發(fā)現(xiàn)Jo2 mAb對(duì)HepaRG細(xì)胞體外無明顯致凋亡作用。 2.證實(shí)Jo2 mAb體內(nèi)可致小鼠急性肝損傷,HepaRG細(xì)胞移植能保護(hù)小鼠避免發(fā)生Jo2 mAb所致急性肝損傷,顯著改善小鼠的存活率。經(jīng)HepaRG細(xì)胞移植后發(fā)現(xiàn),其雖能在SCID小鼠體內(nèi)少量存活,但無移植細(xì)胞的增殖優(yōu)勢(shì),在Jo2 mAb啟動(dòng)細(xì)胞凋亡途徑后,可能不具備抗擊凋亡的能力,生長、增殖空間有限。 3.建立Bcl-2基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepaRG細(xì)胞株。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bcl-2的HepaRG細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、生物學(xué)功能上與HepaRG細(xì)胞無異,能在細(xì)胞、分子以及蛋白水平表達(dá)Bcl-2蛋白。 4.采用轉(zhuǎn)Bcl-2的HepaRG細(xì)胞移植,聯(lián)合Jo2 mAb腹腔注射誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的方法,建立的嵌合鼠肝組織能表達(dá)Bcl-2蛋白。HepaRG細(xì)胞不僅能在小鼠體內(nèi)存活,而且保持人肝細(xì)胞的特性,產(chǎn)生人白蛋白,維持近24w,成功建立HepaRG細(xì)胞-鼠嵌合肝動(dòng)物模型。在所建立的HepaRG細(xì)胞-鼠嵌合肝動(dòng)物模型中,發(fā)現(xiàn)HepaRG細(xì)胞轉(zhuǎn)Bcl-2基因的表達(dá),使其在小鼠體內(nèi)替代率增高,存活時(shí)間延長,數(shù)量增多,人白蛋白的表達(dá)含量增加。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1658254