本文選題：Bcl-2　切入點：Fas抗體/Jo2　出處：《第三軍醫(yī)大學》2009年博士論文

【摘要】： 肝臟是最早進行細胞移植實驗的器官之一。人肝細胞移植不僅可作為治療肝衰竭和多種代謝性疾病的有效手段,而且將人肝細胞移植到動物體內(nèi),形成"嵌合肝",甚至在動物體內(nèi)重建人類肝組織,以期獲得可感染肝炎病毒的實驗動物模型,成為當前研究的一個重要方向。 要想建立理想的人鼠嵌合肝動物模型,使人肝細胞在小鼠體內(nèi)長時間存活并保持功能,就必須滿足外源肝細胞移植到動物體內(nèi)定植的基本條件:一是對外源肝細胞無免疫排斥;二是宿主肝細胞形成再生需求和環(huán)境;三是移植肝細胞較宿主肝細胞更具增殖優(yōu)勢。 為了尋找不僅能使小鼠肝損傷,形成再生需求和環(huán)境,同時又賦予移植細胞更強生長優(yōu)勢的方法。我們設想,利用Fas抗體誘導小鼠肝細胞進入可控的凋亡狀態(tài),移植轉(zhuǎn)Bcl-2基因的人肝細胞具有的抗凋亡能力使其在鼠肝內(nèi)具有更強的增殖優(yōu)勢,來促進人肝細胞在嵌合鼠體內(nèi)增殖。 Fas是一種細胞表面信號分子,屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員。當與Fas配體或特異性抗體(如Jo2 mAb)結合后,Fas啟動細胞凋亡。Bcl-2是一種細胞漿蛋白,它屬于常生長蛋白質(zhì)家族(ever-growing family of protein)中的一員。該家族在細胞凋亡中起著主導作用。研究證明,小鼠肝細胞對Jo2 mAb所誘導的細胞凋亡非常敏感,給小鼠反復注射小劑量的Jo2 mAb不會引起肝外組織器官明顯損傷,卻可造成肝細胞大面積的凋亡,引起動物出現(xiàn)暴發(fā)性肝衰竭癥狀和死亡。而表達Bcl-2的轉(zhuǎn)基因肝細胞可完全阻止由Jo2mAb引起的肝細胞凋亡。 HepaRG細胞是從慢性丙型肝炎感染的肝癌患者體內(nèi)非瘤組織分離而得的細胞株,在廣義上屬于永生化細胞株的范疇。HepaRG細胞與正常的肝細胞相比,具有相似的形態(tài)學和生理學功能;作為潛能祖細胞,具有向肝細胞和膽管上皮細胞雙向分化的潛能。細胞培養(yǎng)顯示,HepaRG細胞在分化過程中,能持續(xù)表達藥物代謝酶(I項藥代酶P450和Ⅱ項藥代酶)達6w之久;體內(nèi)移植表明,HepaRG細胞對裸鼠未顯示明顯的致瘤性,在Alb-uPA/SCID小鼠體內(nèi),保持了分化功能,并具有成熟肝細胞的生物學特性,說明HepaRG可作為藥物代謝研究和細胞移植的良好的體內(nèi)外模型。 本研究將基于Bcl-2抗凋亡特性,以轉(zhuǎn)染了Bcl-2基因的HepaRG細胞為移植細胞,聯(lián)合Fas抗體誘導SCID小鼠肝細胞凋亡來構建人鼠嵌合肝動物模型。因為Jo2 mAb可誘導小鼠肝細胞的凋亡,給外源性肝細胞生長讓出“空間”,提供了肝再生需求及環(huán)境,為移植的外源性肝細胞提供了增殖信號。同時,表達Bcl-2轉(zhuǎn)基因的移植肝細胞能抵御Jo2 mAb引起的肝細胞凋亡,使移植肝細胞具有較鼠肝細胞更強的生長和生存優(yōu)勢。此外,選擇SCID小鼠作為移植受體可避免免疫排斥反應的發(fā)生,所以該策略很好地滿足了異種細胞移植的基本條件。 方法和結果 1.Jo2 mAb對體外小鼠肝細胞和HepaRG細胞培養(yǎng)的影響 體外培養(yǎng)小鼠肝細胞和HepaRG細胞,加入不同濃度的Jo2 mAb(終濃度為10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL),以了解Jo2 mAb作為誘導小鼠肝細胞凋亡的手段,對移植的HepaRG細胞是否也有相同影響。 加入Jo2 mAb 5μg/mL于72h、10μg/mL于48h和72h對小鼠肝細胞有致凋亡征象,表現(xiàn)為細胞體積縮小、胞質(zhì)濃縮、胞核固定,細胞折光率明顯增加;瑞氏染色出現(xiàn)凋亡小體;MTT測定該三時相點細胞抑制率分別為52%、51%和67%,與空白對照組有顯著性差異P0.05㖞;小鼠肝細胞DNA出現(xiàn)明顯排列成梯狀的分子條帶,而ALT、AST以及LDH無明顯變化。對照HepaRG細胞不同濃度的Jo2 mAb作用未發(fā)現(xiàn)明顯的凋亡征象。 2.經(jīng)Jo2 mAb體內(nèi)誘導小鼠肝細胞凋亡后的HepaRG細胞移植研究 采用Jo2 mAb腹腔注射,劑量為0.3mg/kg,誘導20只SCID小鼠制備急性肝損傷模型,24h內(nèi)按照實驗動物隨機分組方法,挑選小鼠經(jīng)脾移植2×106個HepaRG細胞為實驗組(10只),未經(jīng)HepaRG細胞移植為對照組(10只)。 實驗組小鼠有9只存活超過4w,而對照組小鼠3d內(nèi)先后死亡9只,實驗組血清ALT和AST趨于正常,顯著低于對照組(P 0.01),且存活時間顯著高于對照組(P 0.01)。實驗組經(jīng)HepaRG細胞移植后肝組織結構完整,無明顯出血、壞死,而對照組肝組織結構模糊,出血和大面積點、片狀壞死明顯。實驗組移植后4w免疫組化可見人白蛋白、CK18、人Hep Par 1陽性表達細胞,肝組織免疫熒光可見人白蛋白陽性細胞的表達,但表達數(shù)量較少。 3.可穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Bcl-2的HepaRG細胞株的建立 雖然Jo2 mAb對HepaRG細胞體外無致凋亡作用,但鑒于移植到小鼠體內(nèi)的HepaRG細胞盡管能存活,但不具有增殖優(yōu)勢,經(jīng)Jo2 mAb啟動細胞凋亡途徑,缺乏抗凋亡能力。為此,我們將pSFFV-neo Bcl-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepaRG細胞,經(jīng)過G418和抗Fas抗體篩選,獲得雙抗性克隆,從而建立穩(wěn)定表達Bcl-2蛋白的HepaRG細胞株。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Bcl-2蛋白的HepaRG細胞株,培養(yǎng)14d形態(tài)學無變化。免疫組化檢測到Bcl-2以及人白蛋白的表達,采用RT-PCR法檢測到Bcl-2的mRNA以及Western blot法檢測到Bcl-2表達的蛋白,而對照未轉(zhuǎn)染Bcl-2的HepaRG細胞以及轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的HepaRG細胞均未見Bcl-2的陽性表達。 4.Bcl-2/HepaRG細胞-鼠嵌合肝動物模型的構建 將2×106個Bcl-2轉(zhuǎn)基因HepaRG細胞經(jīng)脾移植到SCID小鼠體內(nèi),移植后1d始給予Jo2 mAb 0.2mg/Kg腹腔注射,1次/周,持續(xù)10周建立Bcl-2/HepaRG細胞-鼠嵌合模型(n=43);移植HepaRG細胞,同樣給予Jo2 mAb注射建立HepaRG細胞-鼠嵌合模型(n=25);移植HepaRG細胞,未腹腔注射Jo2 mAb的小鼠為對照組(n=14)。 三組小鼠均能存活至24w。Bcl-2/HepaRG細胞-鼠嵌合肝模型肝組織免疫組化和免疫熒光可見Bcl-2蛋白的表達,且隨著移植時間的延長,從2w開始增加,16w表達最強,此后逐漸衰減,至24w降到最低。 三組小鼠肝組織免疫組化都能檢測到人白蛋白和CK18的表達,免疫熒光還可檢測到Ki67的表達。Bcl-2/HepaRG細胞-鼠嵌合肝人白蛋白、CK18以及Ki67陽性持續(xù)時間為2~24w,整體趨勢為隨著移植后時間推移,呈先升高后逐漸下降的過程,在移植后16w出現(xiàn)峰值,人肝細胞在嵌合鼠肝組織中的替代率約為22%;而HepaRG細胞-鼠嵌合肝上述三指標陽性表達時間為2~20w,高峰時間為12w,替代率約為15%;對照組的表達時間就僅為2~12w,高峰時間8w,替代率僅為8%左右。此外,Bcl-2/HepaRG細胞-鼠嵌合肝4~24w、HepaRG細胞-鼠嵌合肝4~20w和對照組4~12w肝組織可通過RT-PCR檢測到人白蛋白mRNA的陽性條帶、Western Blot于血清中可檢測到人白蛋白,同時經(jīng)ELISA可定量檢測到血清中人白蛋白的含量。Bcl-2/HepaRG細胞-鼠嵌合肝模型人血清白蛋白高峰值為0.101μg/mL,出現(xiàn)在16w;而HepaRG細胞-鼠嵌合肝模型人血清白蛋白高峰值為0.042μg/mL,出現(xiàn)在12w;對照組人血清白蛋白高峰值為0.022μg/mL,出現(xiàn)在8w。 結論: 1.證實Jo2 mAb可體外誘導小鼠肝細胞凋亡。發(fā)現(xiàn)Jo2 mAb對HepaRG細胞體外無明顯致凋亡作用。 2.證實Jo2 mAb體內(nèi)可致小鼠急性肝損傷,HepaRG細胞移植能保護小鼠避免發(fā)生Jo2 mAb所致急性肝損傷,顯著改善小鼠的存活率。經(jīng)HepaRG細胞移植后發(fā)現(xiàn),其雖能在SCID小鼠體內(nèi)少量存活,但無移植細胞的增殖優(yōu)勢,在Jo2 mAb啟動細胞凋亡途徑后,可能不具備抗擊凋亡的能力,生長、增殖空間有限。 3.建立Bcl-2基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepaRG細胞株。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bcl-2的HepaRG細胞在形態(tài)學、生物學功能上與HepaRG細胞無異,能在細胞、分子以及蛋白水平表達Bcl-2蛋白。 4.采用轉(zhuǎn)Bcl-2的HepaRG細胞移植,聯(lián)合Jo2 mAb腹腔注射誘導肝細胞凋亡的方法,建立的嵌合鼠肝組織能表達Bcl-2蛋白。HepaRG細胞不僅能在小鼠體內(nèi)存活,而且保持人肝細胞的特性,產(chǎn)生人白蛋白,維持近24w,成功建立HepaRG細胞-鼠嵌合肝動物模型。在所建立的HepaRG細胞-鼠嵌合肝動物模型中,發(fā)現(xiàn)HepaRG細胞轉(zhuǎn)Bcl-2基因的表達,使其在小鼠體內(nèi)替代率增高,存活時間延長,數(shù)量增多,人白蛋白的表達含量增加。
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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R-332

【參考文獻】

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本文編號：1658254