本文選題：核酸疫苗　切入點：pVAX1-CpG-Loop　出處：《河北醫(yī)科大學》2009年碩士論文

【摘要】： 目的犬傳染性肝炎(Infectious canine hepatitis ICH)是由犬傳染性肝炎病毒(ICHV)引起的一種常見的急性敗血性傳染病,傳染性強,無明顯季節(jié)性,各種品系,不同年齡的犬均可被感染,尤其以六周齡至一歲以內(nèi)的犬發(fā)病率高,死亡率達10～40%,對養(yǎng)犬業(yè)和實驗犬的飼養(yǎng)均可造成極大的危害。預防本病發(fā)生的主要措施就是加強飼養(yǎng)管理,嚴格獸醫(yī)衛(wèi)生措施和定期免疫接種。目前,在實驗用犬和其他養(yǎng)犬業(yè),主要采取定期接種ICHV弱毒疫苗的方法。核酸疫苗是近年發(fā)展起來的一項新的免疫技術(shù),與傳統(tǒng)疫苗相比有諸多優(yōu)點,被稱為第三代疫苗。核酸疫苗免疫接種后,可在動物體內(nèi)誘導體液免疫應答,對動物產(chǎn)生免疫保護作用�？贵w是由抗原刺激B細胞經(jīng)分化和增殖后產(chǎn)生的免疫球蛋白,因此在機體接受免疫接種以后,檢測機體的抗體水平,成為評價機體免疫反應及疫苗免疫效果的一個重要體液免疫指標。中和抗體是病原微生物侵襲機體后,所產(chǎn)生的具有中和相應病原微生物及其毒性產(chǎn)物(毒素),使病原微生物喪失感染能力或毒力的抗體,是進行病毒感染機制研究的重要工具。中和抗體水平的監(jiān)測是反映疫苗免疫原性的一個重要體液免疫指標。 核酸疫苗作為一種新興的疫苗,大量實驗表明在感染性疾病、腫瘤等的預防和治療方面具有很大的潛力。本研究室采用基因重組技術(shù)構(gòu)建了含有Loop1、Loop2的重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop免疫小鼠后,誘導小鼠產(chǎn)生針對抗原的特異性IgG抗體和抑制病毒感染的中和抗體。為確定此核酸疫苗對犬的免疫應答效果,本研究采用pVAX1-CpG-Loop對Beagle犬進行免疫,對其體液免疫應答效果進行評價。旨在探索pVAX1-CpG-Loop作為預防犬傳染性肝炎核酸疫苗的有效性,為犬傳染性肝炎病毒核酸疫苗的開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。 方法 1質(zhì)粒的提取及抗原蛋白的誘導表達和純化 采用SDS-堿裂解法大量提取重組質(zhì)粒pVAX1 CpG -Loop,采用聚乙二醇沉淀法純化質(zhì)粒。并對提取的重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop經(jīng)分光光度計進行純度和濃度測定。將原核表達質(zhì)粒pET28a(+)Loop轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),搖菌并誘導重組Loop蛋白的表達。用尿素溶解沉淀,采用鎳離子親和層析柱純化重組蛋白,透析、復性后濃縮目的蛋白。 2實驗動物的分組及免疫 6只Beagle犬進行隨機編號:1號、2號、3號犬:分別于0、8、16周注射重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop 400μg、600μg、800μg /只/次,最后一次與相同劑量的抗原蛋白共免疫;4號、5號、6號犬:分別于0、8、16周僅注射重組質(zhì)粒pVAX1- CpG-Loop 400μg、600μg、800μg /只/次,每只動物均于免疫前經(jīng)雙側(cè)股四頭肌注射25㳠滅菌蔗糖1ml/只,15min后于相同部位進行質(zhì)粒免疫,抗原蛋白免疫于頸部皮下。7號犬:為已接種傳統(tǒng)疫苗對照。 3攻毒試驗 在第3次接種6周后,對實驗犬進行攻毒試驗。取病毒株經(jīng)MDCK細胞增殖,取MDCK細胞培養(yǎng)物(TCID50為10-4.23/0.1ml),在麻醉狀態(tài)下,通過口腔粘膜感染病毒,劑量為1 ml/只。 4免疫動物的體液免疫效果評價 間接ELISA法檢測免疫犬特異性IgG抗體,以包被液稀釋的犬傳染性肝炎病毒(1:5稀釋病毒),100μl/孔包被酶聯(lián)板,4℃過夜;去除包被液,以PBST洗滌3次,20㳠胎牛血清-PBST封閉,37℃于濕盒中放置1h;然后加入待檢的不同稀釋度的犬血清100μl/孔,37℃于濕盒中放置1h,洗滌3次;加入HRP標記的兔抗狗IgG抗體(1:2000),37℃于濕盒中放置1h,洗滌3次;加入顯色底物OPD溶液100μl/孔,避光顯色;加入50μl/孔2mol/L H2SO4終止反應。酶標分析儀檢測492nm波長下的OD值(OD492)。以P/N大于1.8為陽性。 間接免疫熒光試驗( IFA )測定血清抗體效價,免疫后靜脈采血,分離血清,將待測血清置56℃滅活30min,血清樣品用PBS稀釋為1:10、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800 6個稀釋度,滴加于抗原片上,設(shè)PBS為空白陰性對照。在37℃溫箱中孵育30min;PBS振蕩洗滌3次,每次5 min;加1:200稀釋度的羊抗犬IgG FITC標記物,在37℃溫箱中孵育30min;PBS振蕩洗滌3次,每次5min;加1:2000稀釋度的伊文思藍,在37℃溫箱中染色30min; PBS振蕩洗滌3次,每次5min;最后用蒸餾水沖洗,室溫吹干;用90%緩沖甘油液封片,在熒光顯微鏡下觀察。 中和試驗測定血清中和抗體效價:收集各犬的血清,滅活后采用固定病毒-稀釋血清法進行中和實驗。用DMEM將血清樣品做連續(xù)倍比稀釋,分別在上述血清中加入等量的適當?shù)味鹊牟《?100TCID50),充分混勻后置于37℃孵育1h;接種至敏感細胞(MDCK),100μl /孔,設(shè)兩復孔,并設(shè)置正常細胞對照;37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1h;棄去血清-病毒混合液,用Hanks液洗滌細胞3次,加入細胞維持液,37℃培養(yǎng)3天觀察細胞病變。 結(jié)果 1重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop的大量提取 用堿裂解法大量提取所得的真核重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop經(jīng)分光光度計進行純度和濃度測定,OD260/OD280分別為1.82、1.9、1.88。 2 Loop蛋白的誘導、表達和純化 pET28aLoop重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3),IPTG誘導表達,做SDS-PAGE電泳,誘導表達菌在36 kDa處出現(xiàn)一條蛋白表達條帶,對照組無此條帶。用鎳離子親和層析柱純化表達蛋白,SDS-PAGE電泳分析,目的蛋白純度在95%至98%之間。 3間接ELISA測定免疫犬血清IgG水平 攻毒前各實驗犬產(chǎn)生的特異性抗體無顯著變化,其中1號犬及7號犬所產(chǎn)生的抗體效價明顯高于其它犬。攻毒后各實驗犬所產(chǎn)生的抗體效價均明顯增高,7號犬在第一周達到最高值,其它實驗犬在第三周達到最高值,后逐漸下降持續(xù)至27周。 4間接免疫熒光試驗(IFA)測定免疫犬血清總IgG抗體水平 攻毒前1號、4號、5號和7號實驗犬檢測到IgG抗體滴度持續(xù)為1:10,其余實驗犬未檢測到特異性抗體。攻毒后,在第五天抗體水平開始升高,其中1號、5號和7號犬達1:50,4號犬仍為1:10,2號、3號和6號犬未檢測到IgG抗體。從第一周開始各試驗犬抗體水平開始顯著升高,1號犬和4號犬在三周達最高滴度為1:400,其它各犬在第一周達最高滴度為1:200。各犬抗體逐漸下降持續(xù)至第7周,于第14周檢測不到抗體。 5中和試驗測定免疫犬血清中和抗體水平 攻毒前,除7號犬(中和抗體效價為1:8)其余各實驗犬均未檢測到中和抗體。在攻毒后,所有實驗犬自第5天開始檢測到中和抗體,1號犬較其它各實驗犬抗體滴度高為1:128;1號、4號、5號和7號犬在第一周達最高滴度1:1024,其它各犬在第三周達其最高滴度,至第五周顯著下降后逐漸下降至第27周。 結(jié)論 1本室構(gòu)建的犬傳染性肝炎病毒核酸疫苗pVAX1-CpG-Loop能夠誘發(fā)Beagle犬產(chǎn)生較好的體液免疫應答反應。 2本室構(gòu)建的犬傳染性肝炎病毒核酸疫苗pVAX1-CpG-Loop能夠誘發(fā)Beagle犬產(chǎn)生中和抗體。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：1658096