本文選題：核酸疫苗　切入點(diǎn)：pVAX1-CpG-Loop　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】： 目的犬傳染性肝炎(Infectious canine hepatitis ICH)是由犬傳染性肝炎病毒(ICHV)引起的一種常見的急性敗血性傳染病,傳染性強(qiáng),無明顯季節(jié)性,各種品系,不同年齡的犬均可被感染,尤其以六周齡至一歲以內(nèi)的犬發(fā)病率高,死亡率達(dá)10～40%,對(duì)養(yǎng)犬業(yè)和實(shí)驗(yàn)犬的飼養(yǎng)均可造成極大的危害。預(yù)防本病發(fā)生的主要措施就是加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,嚴(yán)格獸醫(yī)衛(wèi)生措施和定期免疫接種。目前,在實(shí)驗(yàn)用犬和其他養(yǎng)犬業(yè),主要采取定期接種ICHV弱毒疫苗的方法。核酸疫苗是近年發(fā)展起來的一項(xiàng)新的免疫技術(shù),與傳統(tǒng)疫苗相比有諸多優(yōu)點(diǎn),被稱為第三代疫苗。核酸疫苗免疫接種后,可在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答,對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生免疫保護(hù)作用�？贵w是由抗原刺激B細(xì)胞經(jīng)分化和增殖后產(chǎn)生的免疫球蛋白,因此在機(jī)體接受免疫接種以后,檢測機(jī)體的抗體水平,成為評(píng)價(jià)機(jī)體免疫反應(yīng)及疫苗免疫效果的一個(gè)重要體液免疫指標(biāo)。中和抗體是病原微生物侵襲機(jī)體后,所產(chǎn)生的具有中和相應(yīng)病原微生物及其毒性產(chǎn)物(毒素),使病原微生物喪失感染能力或毒力的抗體,是進(jìn)行病毒感染機(jī)制研究的重要工具。中和抗體水平的監(jiān)測是反映疫苗免疫原性的一個(gè)重要體液免疫指標(biāo)。 核酸疫苗作為一種新興的疫苗,大量實(shí)驗(yàn)表明在感染性疾病、腫瘤等的預(yù)防和治療方面具有很大的潛力。本研究室采用基因重組技術(shù)構(gòu)建了含有Loop1、Loop2的重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop免疫小鼠后,誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)抗原的特異性IgG抗體和抑制病毒感染的中和抗體。為確定此核酸疫苗對(duì)犬的免疫應(yīng)答效果,本研究采用pVAX1-CpG-Loop對(duì)Beagle犬進(jìn)行免疫,對(duì)其體液免疫應(yīng)答效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。旨在探索pVAX1-CpG-Loop作為預(yù)防犬傳染性肝炎核酸疫苗的有效性,為犬傳染性肝炎病毒核酸疫苗的開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。 方法 1質(zhì)粒的提取及抗原蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 采用SDS-堿裂解法大量提取重組質(zhì)粒pVAX1 CpG -Loop,采用聚乙二醇沉淀法純化質(zhì)粒。并對(duì)提取的重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop經(jīng)分光光度計(jì)進(jìn)行純度和濃度測定。將原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)Loop轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),搖菌并誘導(dǎo)重組Loop蛋白的表達(dá)。用尿素溶解沉淀,采用鎳離子親和層析柱純化重組蛋白,透析、復(fù)性后濃縮目的蛋白。 2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及免疫 6只Beagle犬進(jìn)行隨機(jī)編號(hào):1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)犬:分別于0、8、16周注射重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop 400μg、600μg、800μg /只/次,最后一次與相同劑量的抗原蛋白共免疫;4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)犬:分別于0、8、16周僅注射重組質(zhì)粒pVAX1- CpG-Loop 400μg、600μg、800μg /只/次,每只動(dòng)物均于免疫前經(jīng)雙側(cè)股四頭肌注射25㳠滅菌蔗糖1ml/只,15min后于相同部位進(jìn)行質(zhì)粒免疫,抗原蛋白免疫于頸部皮下。7號(hào)犬:為已接種傳統(tǒng)疫苗對(duì)照。 3攻毒試驗(yàn) 在第3次接種6周后,對(duì)實(shí)驗(yàn)犬進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。取病毒株經(jīng)MDCK細(xì)胞增殖,取MDCK細(xì)胞培養(yǎng)物(TCID50為10-4.23/0.1ml),在麻醉狀態(tài)下,通過口腔粘膜感染病毒,劑量為1 ml/只。 4免疫動(dòng)物的體液免疫效果評(píng)價(jià) 間接ELISA法檢測免疫犬特異性IgG抗體,以包被液稀釋的犬傳染性肝炎病毒(1:5稀釋病毒),100μl/孔包被酶聯(lián)板,4℃過夜;去除包被液,以PBST洗滌3次,20㳠胎牛血清-PBST封閉,37℃于濕盒中放置1h;然后加入待檢的不同稀釋度的犬血清100μl/孔,37℃于濕盒中放置1h,洗滌3次;加入HRP標(biāo)記的兔抗狗IgG抗體(1:2000),37℃于濕盒中放置1h,洗滌3次;加入顯色底物OPD溶液100μl/孔,避光顯色;加入50μl/孔2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)分析儀檢測492nm波長下的OD值(OD492)。以P/N大于1.8為陽性。 間接免疫熒光試驗(yàn)( IFA )測定血清抗體效價(jià),免疫后靜脈采血,分離血清,將待測血清置56℃滅活30min,血清樣品用PBS稀釋為1:10、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800 6個(gè)稀釋度,滴加于抗原片上,設(shè)PBS為空白陰性對(duì)照。在37℃溫箱中孵育30min;PBS振蕩洗滌3次,每次5 min;加1:200稀釋度的羊抗犬IgG FITC標(biāo)記物,在37℃溫箱中孵育30min;PBS振蕩洗滌3次,每次5min;加1:2000稀釋度的伊文思藍(lán),在37℃溫箱中染色30min; PBS振蕩洗滌3次,每次5min;最后用蒸餾水沖洗,室溫吹干;用90%緩沖甘油液封片,在熒光顯微鏡下觀察。 中和試驗(yàn)測定血清中和抗體效價(jià):收集各犬的血清,滅活后采用固定病毒-稀釋血清法進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)。用DMEM將血清樣品做連續(xù)倍比稀釋,分別在上述血清中加入等量的適當(dāng)?shù)味鹊牟《?100TCID50),充分混勻后置于37℃孵育1h;接種至敏感細(xì)胞(MDCK),100μl /孔,設(shè)兩復(fù)孔,并設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照;37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1h;棄去血清-病毒混合液,用Hanks液洗滌細(xì)胞3次,加入細(xì)胞維持液,37℃培養(yǎng)3天觀察細(xì)胞病變。 結(jié)果 1重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop的大量提取 用堿裂解法大量提取所得的真核重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop經(jīng)分光光度計(jì)進(jìn)行純度和濃度測定,OD260/OD280分別為1.82、1.9、1.88。 2 Loop蛋白的誘導(dǎo)、表達(dá)和純化 pET28aLoop重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá),做SDS-PAGE電泳,誘導(dǎo)表達(dá)菌在36 kDa處出現(xiàn)一條蛋白表達(dá)條帶,對(duì)照組無此條帶。用鎳離子親和層析柱純化表達(dá)蛋白,SDS-PAGE電泳分析,目的蛋白純度在95%至98%之間。 3間接ELISA測定免疫犬血清IgG水平 攻毒前各實(shí)驗(yàn)犬產(chǎn)生的特異性抗體無顯著變化,其中1號(hào)犬及7號(hào)犬所產(chǎn)生的抗體效價(jià)明顯高于其它犬。攻毒后各實(shí)驗(yàn)犬所產(chǎn)生的抗體效價(jià)均明顯增高,7號(hào)犬在第一周達(dá)到最高值,其它實(shí)驗(yàn)犬在第三周達(dá)到最高值,后逐漸下降持續(xù)至27周。 4間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)測定免疫犬血清總IgG抗體水平 攻毒前1號(hào)、4號(hào)、5號(hào)和7號(hào)實(shí)驗(yàn)犬檢測到IgG抗體滴度持續(xù)為1:10,其余實(shí)驗(yàn)犬未檢測到特異性抗體。攻毒后,在第五天抗體水平開始升高,其中1號(hào)、5號(hào)和7號(hào)犬達(dá)1:50,4號(hào)犬仍為1:10,2號(hào)、3號(hào)和6號(hào)犬未檢測到IgG抗體。從第一周開始各試驗(yàn)犬抗體水平開始顯著升高,1號(hào)犬和4號(hào)犬在三周達(dá)最高滴度為1:400,其它各犬在第一周達(dá)最高滴度為1:200。各犬抗體逐漸下降持續(xù)至第7周,于第14周檢測不到抗體。 5中和試驗(yàn)測定免疫犬血清中和抗體水平 攻毒前,除7號(hào)犬(中和抗體效價(jià)為1:8)其余各實(shí)驗(yàn)犬均未檢測到中和抗體。在攻毒后,所有實(shí)驗(yàn)犬自第5天開始檢測到中和抗體,1號(hào)犬較其它各實(shí)驗(yàn)犬抗體滴度高為1:128;1號(hào)、4號(hào)、5號(hào)和7號(hào)犬在第一周達(dá)最高滴度1:1024,其它各犬在第三周達(dá)其最高滴度,至第五周顯著下降后逐漸下降至第27周。 結(jié)論 1本室構(gòu)建的犬傳染性肝炎病毒核酸疫苗pVAX1-CpG-Loop能夠誘發(fā)Beagle犬產(chǎn)生較好的體液免疫應(yīng)答反應(yīng)。 2本室構(gòu)建的犬傳染性肝炎病毒核酸疫苗pVAX1-CpG-Loop能夠誘發(fā)Beagle犬產(chǎn)生中和抗體。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1658096