本文選題：鼠疫耶爾森氏菌　切入點(diǎn)：VNTR　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2009年博士論文

【摘要】： 鼠疫是一種流行在嚙齒動(dòng)物間通過跳蚤傳播的自然疫源性疾病,鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis,以下簡稱鼠疫菌)是鼠疫的病原菌,在歷史上曾經(jīng)引發(fā)三次世界范圍的鼠疫大流行,給人類帶來巨大的災(zāi)難。近年來,鼠疫在亞非地區(qū)的流行有增無減,動(dòng)物間疫情呈活躍態(tài)勢(shì),鼠疫的防治仍是不容忽視的問題。另外,鼠疫菌也是生物武器締約國專家組所確定的標(biāo)準(zhǔn)生物戰(zhàn)劑,非常有可能應(yīng)用于生物戰(zhàn)和生物恐怖襲擊,因此對(duì)鼠疫菌進(jìn)行基因組多態(tài)性研究,建立多態(tài)性數(shù)據(jù)庫,對(duì)疫情爆發(fā)和生物恐怖襲擊發(fā)生時(shí)鼠疫菌的快速鑒定溯源具有非常重要的意義。鼠疫菌在進(jìn)化過程中基因組不斷發(fā)生變異以適應(yīng)新的生態(tài)位,逐漸形成具有不同特點(diǎn)的鼠疫菌菌株。細(xì)菌基因組變異的主要分子策略包括點(diǎn)突變,基因的獲得和缺失、基因重排和重復(fù)序列拷貝數(shù)變化,本研究針對(duì)各種基因組變異形式設(shè)計(jì)了不同的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,系統(tǒng)地考察了鼠疫菌基因組多態(tài)性,篩選出精簡有效的的分子靶標(biāo),建立了中國鼠疫菌快速鑒定溯源系統(tǒng)。同時(shí),通過大量數(shù)據(jù)分析,深入探討了鼠疫菌的適應(yīng)性進(jìn)化以及與之密切相關(guān)的鼠疫自然疫源地形成與擴(kuò)張過程。 基于SNPs分析的鼠疫菌遺傳關(guān)系框架的構(gòu)建 單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)是一種穩(wěn)定的遺傳標(biāo)記,能夠用來推測(cè)物種進(jìn)化方向和進(jìn)化年代,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物遺傳關(guān)系的研究。本研究在Achtman等人研究的基礎(chǔ)上,選擇45個(gè)SNPs位點(diǎn),對(duì)121株涵蓋4個(gè)生物型,分離自不同疫源地和宿主的代表性菌株進(jìn)行了分析,將其分成12個(gè)SNPs型,建立了基于45個(gè)SNPs的鼠疫菌遺傳關(guān)系框架,將鼠疫菌分成3個(gè)進(jìn)化分支,與假結(jié)核耶爾森氏菌相比,Branch 0中SNPs突變最少,認(rèn)為是一個(gè)比較古老的分支,其中包括了0.PE4型的田鼠型菌株和較為古老的0.PE5和0.PE6型的古典型菌株;Branch 1分支中包括了1.ORI的東方型菌株和與之關(guān)系密切的1.ANT的古典型菌株;Branch 2分支中包括了2.MED的中世紀(jì)型菌株和與之關(guān)系密切的2.ANT的古典型菌株。該遺傳關(guān)系框架的建立為使用其他遺傳標(biāo)記對(duì)鼠疫菌進(jìn)行多態(tài)性研究提供了遺傳關(guān)系上的參考。 基于基因獲得和缺失的鼠疫菌基因分型系統(tǒng)的完善 在本實(shí)驗(yàn)室前期研究中,通過芯片比較基因組學(xué)分析和抑制消減雜交技術(shù)(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)在鼠疫菌基因組中鑒定出23個(gè)差異區(qū)段(Different region,DFR),并對(duì)大量菌株進(jìn)行了分析。本研究對(duì)前期獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行補(bǔ)充驗(yàn)證,對(duì)最終909株鼠疫菌的DFR數(shù)據(jù)進(jìn)行全面系統(tǒng)的分析,完善了基于DFR中國鼠疫菌基因分型體系,將909株中國鼠疫菌代表株分成32個(gè)基因組型,同時(shí)提出了主要基因組型和次要基因組型的概念,主要基因組型呈明顯的疫源地特異性,但是鑒于DFR分型方法分辨率低的局限性,仍存在不同疫源地的菌株具有同一基因組型的情況。通過與完成測(cè)序的鼠疫菌及假結(jié)核菌DFR譜的比較,我們得以在一定程度上探討了中國與國外鼠疫菌的差異,得出一系列有意義的推論:基于減數(shù)進(jìn)化的理論,本研究的結(jié)果顯示中國的東方型菌株較國外的東方型菌株古老,支持了東方型菌株起源于中國的推論;新疆鼠疫菌的DFR譜呈現(xiàn)出高度的多態(tài)性,說明新疆是中國與中亞鼠疫菌頻繁交換傳播的通道。DFR分型方法操作簡便,成本低廉,適用于大量菌株的快速分型,隨著盡可能多的新DFR的鑒定,DFR分型方法會(huì)日臻完善。 基于串聯(lián)重復(fù)序列的鼠疫菌基因組多態(tài)性研究 鼠疫菌是一類比較年輕的菌種,進(jìn)化時(shí)間短,基因組中還沒有積累足夠多的變異,因此需要一種多態(tài)性高的遺傳標(biāo)記來區(qū)分近緣菌株。本研究采用高分辨率的MLVA(multi- locus VNTR analysis,多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列分析)方法,對(duì)鼠疫菌基因組中可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(Variable Number of Tandem Repeat,VNTR)進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。 目前在鼠疫菌MLVA研究領(lǐng)域中有兩套較為常用的位點(diǎn),一套是法國第十一大學(xué)的Vergnaud博士實(shí)驗(yàn)室鑒定的25個(gè)位點(diǎn),另一套是美國Arizona大學(xué)Keim博士實(shí)驗(yàn)室鑒定的42個(gè)位點(diǎn)。我們首先選擇Vergnaud等人鑒定的適合瓊脂糖凝膠電泳分析的25個(gè)位點(diǎn),對(duì)383株中國代表性鼠疫進(jìn)行分析,通過與法國和俄羅斯實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)交流,將共計(jì)近500株來自中國、前蘇聯(lián)、蒙古及部分歐洲地區(qū)的鼠疫菌分成350個(gè)基因型。這25個(gè)位點(diǎn)分辨率高,能很好地區(qū)分DFR方法不能分開的來自L和M疫源地、G和H疫源地及I和K1疫源地菌株。綜合國外數(shù)據(jù),我們首次深入探討了中國與國外菌株的關(guān)系,推測(cè)了鼠疫菌傳播及自然疫源地?cái)U(kuò)張模式。由于方法學(xué)的局限性,25個(gè)VNTR位點(diǎn)的平均重復(fù)基序大小為17bp,不能夠代表廣泛分布于基因組中VNTR。 在進(jìn)一步的研究中,我們選擇了94株具備SNP分析數(shù)據(jù)的代表性菌株對(duì)基于上述兩套位點(diǎn)的分型聚類關(guān)系進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)與SNPs遺傳關(guān)系框架相比,兩套位點(diǎn)都存在一定的局限性。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是國外鼠疫菌菌型較單一,導(dǎo)致對(duì)VNTR位點(diǎn)選擇有所偏差。本研究利用中國鼠疫菌資源豐富的優(yōu)勢(shì)對(duì)鼠疫菌基因組中的VNTR位點(diǎn)進(jìn)行了系統(tǒng)的篩選,最終獲得了18個(gè)多態(tài)性高,與SNPs框架相比能夠較好反映鼠疫菌各組群聚類關(guān)系的位點(diǎn),為鼠疫菌的快速鑒定溯源提供精簡有效的分子靶標(biāo),同時(shí)研究中獲取的近10萬個(gè)基因組多態(tài)性數(shù)據(jù)大大豐富了本室前期建立的鼠疫菌基因組多態(tài)性數(shù)據(jù)庫,為鼠疫菌的鑒定溯源提供了寶貴資料。 基于插入序列的鼠疫菌基因分型方法的探索 插入序列(Insertion Sequence, IS)是一種可移動(dòng)的DNA元件,在轉(zhuǎn)座酶的作用下可以從基因組中的一個(gè)位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位點(diǎn),促進(jìn)了基因組的重排、改變了基因的表達(dá),是細(xì)菌基因組變異的主要?jiǎng)恿χ�。本研究�?duì)以前基于PCR的IS研究方法進(jìn)行探討,發(fā)現(xiàn)由于鼠疫菌基因組中插入序列重排情況非常復(fù)雜,僅僅依據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果陰性或陽性判定IS的插入狀態(tài)會(huì)給分型結(jié)果造成偏差,影響系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的正確構(gòu)建。本研究為今后IS在鼠疫菌基因組中的多態(tài)性研究積累了寶貴經(jīng)驗(yàn)。 中國鼠疫菌快速鑒定溯源系統(tǒng)的建立 對(duì)本研究中所獲得的大量數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析,發(fā)現(xiàn)幾種遺傳標(biāo)記在鼠疫菌基因組多態(tài)性研究中所起的作用各有千秋。SNPs作為一種穩(wěn)定的遺傳標(biāo)記,能夠準(zhǔn)確地反映出鼠疫菌各組群之間的遺傳關(guān)系,確定進(jìn)化方向和進(jìn)化時(shí)間,適合用于鼠疫菌的微進(jìn)化研究,但分辨率差,成本較高,不利于作為一種常規(guī)檢測(cè)手段普及應(yīng)用。IS的研究僅依靠簡單的PCR判斷插入序列的有無大大降低了分辨率,難以獲得準(zhǔn)確可靠的結(jié)果�；贒FR的分型方法操作簡便,重現(xiàn)性好,成本低廉,易于普及,但由于該方法分辨率不高,無法對(duì)所有鼠疫菌株進(jìn)行準(zhǔn)確的區(qū)分和溯源。多位點(diǎn)VNTR分析分辨率高,合理選擇位點(diǎn)能正確反映菌株間的聚類關(guān)系,但操作較為繁瑣耗時(shí)。綜合DFR和MLVA方法的特點(diǎn),本研究選用5個(gè)DFR位點(diǎn)和8個(gè)VNTR位點(diǎn),建立了中國鼠疫菌快速鑒定溯源系統(tǒng)。借助鼠疫菌基因組多態(tài)性數(shù)據(jù)庫及相關(guān)分析軟件,可以將菌株定位到不同的地理位置。為將來疫情爆發(fā)或生物恐怖襲擊發(fā)生時(shí)鼠疫菌的快速鑒定溯源提供了有力工具。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1653281