本文選題：糖基化修飾　切入點：糖基轉(zhuǎn)移酶　出處：《山西醫(yī)科大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】： 目的: 本研究旨在解決以下問題: 1.構(gòu)建糖基轉(zhuǎn)移酶Glt25D2新基因的原核表達(dá)載體,誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá),并對其進(jìn)行純化,制備融合蛋白多克隆抗體。 2.明確該糖基轉(zhuǎn)移酶在肝細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位。 3.該糖基轉(zhuǎn)移酶與HBV LHBs之間可能的關(guān)系。 4.該糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)對LHBs表達(dá)可能的影響。 5.原核表達(dá)蛋白的供體底物特異性分析。 方法: 1.應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription PCR,RT-PCR)技術(shù),以人肝母瘤細(xì)胞系HepG2細(xì)胞提取的總RNA為模板,合成cDNA,再以此cDNA為模版擴增目的基因Glt25D2的全長CDs,克隆至pGEM-T-EASY載體,測序正確后將目的基因插入原核表達(dá)載體pET32a中,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá),并通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析、免疫印跡(Western blot)分析證實融合蛋白表達(dá)的特異性。大量誘導(dǎo)該蛋白表達(dá)后,利用親和層析法對表達(dá)蛋白進(jìn)行純化及柱上復(fù)性。 2.純化的融合蛋白免疫新西蘭大白兔,獲得抗Glt25D2融合蛋白的多克隆抗體。以純化的融合蛋白為抗原,同時以免疫前后的兔血清作為一抗,利用Western blot技術(shù)和ELISA方法對多克隆抗體進(jìn)行特異性分析和效價檢測。 3.利用激光共聚焦技術(shù)觀察Glt25D2在細(xì)胞內(nèi)的分布特征,以及與LHBs之間的可能共定位關(guān)系。 4.利用免疫共沉淀技術(shù)來驗證Glt25D2與LHBs之間可能的相互作用。 5.通過哺乳動物雙雜交技術(shù)來驗證Glt25D2與HBV-LHBS在細(xì)胞內(nèi)的相互作用關(guān)系。 6.利用RNAi技術(shù),觀察下調(diào)Glt25D2表達(dá)對LHBs表達(dá)可能的影響。構(gòu)建RNAi干擾質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,96小時后收獲細(xì)胞,提取總RNA,通過實時熒光定量PCR技術(shù)篩選有效序列;用有效序列轉(zhuǎn)染HepG2.215細(xì)胞,通過流式細(xì)胞分選儀分選轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞,通過實時熒光PCR定量分析GLT25D2基因沉默后對LHBs的影響。 結(jié)果: 1.人肝母瘤細(xì)胞系HepG2經(jīng)10%小牛血清DMEM培養(yǎng)36h后,Trizol法從HEPG2細(xì)胞中提取總RNA。行1%瓊脂糖凝膠電泳顯示目的條帶:28s RNA、18s RNA和5s RNA。經(jīng)RT-PCR擴增獲得人肝母瘤細(xì)胞cDNA。 2.成功構(gòu)建Glt25D2的原核表達(dá)載體pET32a-Glt25D2,轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)Glt25D2融合蛋白,經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析得到證實; 3.純化Glt25D2融合蛋白并成功制備兔抗Glt25D2多克隆抗體。ELISA檢測證實該抗體效價＞1:2560000,Western blot檢測證明該抗體有較好的特異性。 4.分別構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-Glt25D2、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出口蛋白ERgic-53真核表達(dá)質(zhì)粒pDsRED-N1-ERgic-53,共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。激光共聚焦顯示Glt25D2與ERgic-53存在共定位現(xiàn)象,提示該糖基轉(zhuǎn)移酶定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。 5.Glt25D2與LHBs之間的相互作用:成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pACT-Glt25D2及pBIND-LHBs。通過哺乳動物雙雜交技術(shù),免疫共沉淀技術(shù)證實Glt25D2與HBV包膜蛋白在細(xì)胞內(nèi)有相互作用。激光共聚焦觀察顯示,Glt25D2與LHBs之間存在明確的共定位現(xiàn)象。 6.利用Biacore體外分子相互作用分析儀,證實Glt25D2具有較強的鈣離子結(jié)合活性及一定的唾液酸結(jié)合活性。 7.成功構(gòu)建shRNA干擾質(zhì)粒,并篩選出最有效的shRNA表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞,通過流式細(xì)胞分選儀分選轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞,通過實時熒光定量PCR證實Glt25D2基因表達(dá)下調(diào)后,LHBs mRNA表達(dá)相應(yīng)下調(diào)。 結(jié)論: 1.Glt25D2原核表達(dá)融合蛋白分子量90 kDa。 2.免疫試驗動物制備的Glt25D2蛋白多克隆抗體具有較高的Glt25D2結(jié)合活性。 3.Glt25D2與ERgic-53內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出口蛋白存在共定位關(guān)系,提示Glt25D2定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。 4.體外原核表達(dá)的Glt25D2融合蛋白具有鈣離子結(jié)合活性和特異性唾液酸結(jié)合活性,提示該酶可能是一個催化蛋白質(zhì)O-糖基化修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶,可能具有唾液酸基轉(zhuǎn)移酶活性。 5.以下證據(jù)證實Glt25D2可能是催化HBV包膜蛋白LHBs O-糖基化修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶:(1)激光共聚焦技術(shù)證實Glt25D2與LHBs存在共定位關(guān)系;(2)免疫共沉淀技術(shù)證實Glt25D2與LHBs之間存在相互作用;(3)哺乳類動物雙雜交技術(shù)證實Glt25D2與LHBs之間存在相互作用。 6.Glt25D2表達(dá)下調(diào)對HepG2.2.15細(xì)胞LHBs mRNA表達(dá)有負(fù)調(diào)節(jié)作用,提示該酶可能與HBV包膜蛋白的O-糖基化修飾有關(guān)。該結(jié)論與免疫共沉淀及哺乳類動物雙雜交的結(jié)果一致,提示該糖基轉(zhuǎn)移酶可能是一個與HBV包膜大蛋白的O-糖基化修飾有關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶。
[Abstract]:Objective:
The purpose of this study is to solve the following problems:
1. the prokaryotic expression vector of the new glycosyltransferase Glt25D2 gene was constructed, and the fusion protein was induced and purified to prepare the polyclonal antibody of the fusion protein.
2. the expression of the glycosyltransferase in the liver cells was clearly defined.
3. the possible relationship between the glycosyltransferase and HBV LHBs.
4. the expression of glycosyltransferase may affect the expression of LHBs.
The specificity analysis of donor substrate of 5. prokaryotic expression protein.
Method:
1. application of reverse transcriptase polymerase chain reaction (Reverse transcription PCR RT-PCR) technology, with the total RNA of HepG2 cells from human liver tumor cell line parent as template for synthesis of cDNA, then cDNA full-length CDs template Glt25D2 amplification of the gene, cloned into pGEM-T-EASY vector, sequenced correctly after the gene was inserted into prokaryotic expression vector pET32a, transformed into Escherichia coli BL21 (DE3), induced by IPTG fusion protein expression, and by twelve sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis (Western blot), Western blot analysis confirmed the specificity of fusion protein expression. The expression of a large number of induction, affinity chromatography purification and renaturation of column the expression of protein utilization.
The 2. purified fusion protein immunizing New Zealand rabbit polyclonal antibody to Glt25D2 fusion protein. The purified fusion protein as antigen to immune rabbit serum before and after at the same time as the first antibody to polyclonal antibody specificity analysis and titer detection using Western blot technique and ELISA method.
3. the laser confocal technique was used to observe the distribution of Glt25D2 in the cells and the possible co localization relationship with LHBs.
4. the possible interaction between Glt25D2 and LHBs was verified by immunoprecipitation.
5. the intercellular interaction between Glt25D2 and HBV-LHBS was verified by mammalian double hybridization.
6. the use of RNAi technology, observe the down-regulation of Glt25D2 expression may influence on LHBs. RNAi plasmid was constructed and transfected into HepG2 cells. After 96 hours the cells were harvested, total RNA extraction, screening effective sequences by real-time quantitative PCR technology; effective sequence was transfected into HepG2.215 cells by flow cytometry sorting through transfection positive cells. Real time fluorescence quantitative analysis of PCR GLT25D2 gene silencing effect on LHBs.
Result:
The 1. human hepatoma cell line HepG2 was cultured with 36h after 10% calf serum DMEM. Trizol was used to extract total RNA. from HEPG2 cells. 1% agarose gel electrophoresis showed the target bands: 28s RNA, 18S RNA and 5S 18S.
2., we successfully constructed the prokaryotic expression vector pET32a-Glt25D2 of Glt25D2, transformed BL21 expression bacteria, and IPTG induced the expression of Glt25D2 fusion protein, which was confirmed by SDS-PAGE and Western blot analysis.
3. purified Glt25D2 fusion protein and successfully prepared Rabbit anti Glt25D2 polyclonal antibody..ELISA test confirmed that the titer of the antibody was > 1:2560000, and Western blot detection showed that the antibody had good specificity.
4., we constructed eukaryotic expression plasmid pEGFP-C1-Glt25D2, the eukaryotic expression plasmid pDsRED-N1-ERgic-53 of endoplasmic reticulum export protein, and co transfected HepG2 cells. Confocal laser scanning showed a co localization phenomenon between Glt25D2 and ERgic-53, suggesting that the glycosyltransferase was located in the endoplasmic reticulum, ERgic-53.
The interaction between 5.Glt25D2 and LHBs: the eukaryotic expression plasmids of pACT-Glt25D2 and pBIND-LHBs. by mammalian two hybrid system was successfully constructed, and confirmed that the Glt25D2 technology of HBV envelope protein interactions in cells co immunoprecipitation. Laser confocal microscopy showed that there were clear positioning phenomenon between Glt25D2 and LHBs.
6. using Biacore in vitro molecular interaction analyzer, it was proved that Glt25D2 had strong calcium binding activity and certain sialic acid binding activity.
7., we successfully constructed the shRNA interference plasmid, and screened the most effective shRNA expression plasmid, transfected HepG2.2.15 cells, and transfected positive cells by flow cytometry. After real-time Glt25D2 expression was confirmed, the expression of LHBs mRNA was down regulated after downregulation of Glt25D2 gene expression.
Conclusion:
1.Glt25D2 prokaryotic expression of fusion protein molecular weight 90 kDa.
The Glt25D2 protein polyclonal antibody prepared by 2. immune test animals has high Glt25D2 binding activity.
There is a co localization relationship between 3.Glt25D2 and ERgic-53 endoplasmic reticulum outlet proteins, suggesting that Glt25D2 is located in the endoplasmic reticulum.
Glt25D2 4. in vitro prokaryotic expression of fusion protein with calcium ion binding activity and specificity of sialic acid binding activity, suggesting that the enzyme is a O- protein glycosylation catalyzed glycosylation transferase, may have sialyl transferase activity.
5. the following evidence that Glt25D2 may be a glycosyl catalyzed HBV envelope protein LHBs O- glycosylation transferase: (1) laser scanning confocal microscopy confirmed that Glt25D2 and LHBs are Co located; (2) the interaction between Glt25D2 and LHBs confirmed by immunoprecipitation; (3) mammalian animal hybrid technology confirmed the interaction between Glt25D2 and LHBs.
6.Glt25D2 expression has a negative regulatory effect on HepG2.2.15 cells LHBs mRNA expression, suggesting that the enzyme may O- glycosylation and HBV envelope protein. The conclusion and co immunoprecipitation and mammalian two hybrid animal results, suggesting that the glycosyltransferases may be O- glycosylation HBV a large envelope protein the modification of glycosyl transferase related.

【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R346

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本文編號：1653310