本文選題：創(chuàng)傷弧菌　切入點(diǎn)：金屬蛋白酶　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus,Vv)是弧菌屬第5群細(xì)菌,根據(jù)其生化特性、流行病學(xué)模式以及宿主范圍將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3個(gè)亞型,其中Ⅰ型Vv是導(dǎo)致人群創(chuàng)傷感染及原發(fā)性敗血癥的病原體。創(chuàng)傷弧菌感染一旦出現(xiàn)敗血癥,其死亡率高達(dá)50%以上。原發(fā)性創(chuàng)傷弧菌感染發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢(shì)。我國(guó)國(guó)內(nèi)1990年首次報(bào)道一例,隨后沿海各地區(qū)每年都有散發(fā)病例報(bào)道,其病死率一直居高不下。對(duì)本病的認(rèn)識(shí)不足,發(fā)病早期未能正確診斷,或誤診為藥物超敏反應(yīng)而使用大劑量激素,是造成高病死率的主要原因。因此,認(rèn)清創(chuàng)傷弧菌感染的特點(diǎn)及致病機(jī)制,建立適合的診斷方法至關(guān)重要。 有研究表明金屬蛋白酶(VVP)及溶細(xì)胞毒素(VVC)作為創(chuàng)傷弧菌的兩種胞外產(chǎn)物,與創(chuàng)傷弧菌的致病性密切相關(guān)。雖然目前有大量關(guān)于金屬蛋白酶及溶細(xì)胞毒素與創(chuàng)傷弧菌致病性關(guān)系的研究,例如:有學(xué)者認(rèn)為金屬蛋白酶具有增加血管通透性,引起出血性損傷的作用;而溶細(xì)胞毒素是創(chuàng)傷弧菌分泌的一種水溶性的多肽,是創(chuàng)傷弧菌致病性的重要因素之一。但是目前這兩種胞外產(chǎn)物的具體致病機(jī)制及其在感染創(chuàng)傷弧菌機(jī)體中的定位并未明了。 在對(duì)創(chuàng)傷弧菌感染的診斷方面,由于創(chuàng)傷弧菌引起的腹瀉及最初的癥狀并無特異性,因而實(shí)驗(yàn)室診斷成為最可靠的確診手段。以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的血清學(xué)檢測(cè),是采用單克隆或多克隆抗體,利用抗原抗體特異性反應(yīng),并結(jié)合生物化學(xué)或物理學(xué)方法而建立的免疫學(xué)檢測(cè)方法。由于其操作簡(jiǎn)便、快速,結(jié)果易于判定,在創(chuàng)傷弧菌的鑒定中日益顯出優(yōu)勢(shì)。而以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的血清學(xué)檢測(cè)診斷的實(shí)施,其首要條件是選擇合適的被測(cè)靶抗原,并且獲得針對(duì)靶抗原的高質(zhì)量特異性抗體也是其根本所在。金屬蛋白酶及溶細(xì)胞毒素均是創(chuàng)傷弧菌的胞外產(chǎn)物,且與創(chuàng)傷弧菌的致病性密切相關(guān)。另一方面,分別表達(dá)這兩種胞外產(chǎn)物的基因:vvp和vvhA,在不同創(chuàng)傷弧菌菌株之間也具有高度保守性。因此,金屬蛋白酶及溶細(xì)胞毒素可以作為創(chuàng)傷弧菌感染診斷的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)靶標(biāo)。 無論是研究這兩種胞外產(chǎn)物的具體致病機(jī)制還是要制備以它們?yōu)榘袠?biāo)的Vv免疫檢測(cè)試劑盒,都必須以獲得相應(yīng)的足量、高純度的金屬蛋白酶和溶細(xì)胞毒素為基礎(chǔ)。但是金屬蛋白酶和溶細(xì)胞毒素作為創(chuàng)傷弧菌種特征性的外毒素,它們自然分泌產(chǎn)量并不高,且因方法學(xué)的限制,采用常規(guī)生化方法獲得足量高純度的蛋白相當(dāng)困難。而通過基因工程的方法,就可以在一個(gè)合適的系統(tǒng)中,使外源基因高效表達(dá),從而生產(chǎn)有價(jià)值的蛋白質(zhì),對(duì)其應(yīng)用或進(jìn)行功能的研究。 目的: 通過基因工程的方法,建立使vvp及vvhA基因高效表達(dá)的原核表達(dá)系統(tǒng),從而得到高產(chǎn)量高純度的創(chuàng)傷弧菌金屬蛋白酶和溶細(xì)胞毒素。并在此基礎(chǔ)上制備分別針對(duì)二者的多克隆抗體并初步研究這兩種創(chuàng)傷弧菌胞外產(chǎn)物的具體致病作用及其在感染創(chuàng)傷弧菌機(jī)體中的定位,為揭示Vv的致病機(jī)制、臨床Vv感染的診治及進(jìn)一步免疫檢測(cè)試劑的研究提供依據(jù)。 方法: 1.創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素vvhk基因及金屬蛋白酶vvp基因的體外擴(kuò)增、克隆及序列分析: (1) PCR擴(kuò)增、目的片斷的純化回收及連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α:以Vv基因組DNA為模板,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增vvhA、vvp基因的全長(zhǎng)cds片斷;紫外燈下切下含目的片斷的凝膠,應(yīng)用TakaRa的凝膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化;純化回收的目的片斷與T-載體在連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng);CaCl_2法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。 (2)鑒定及序列分析:氨卞抗性篩選后,用質(zhì)粒小提試劑盒對(duì)具有氨卞抗性的克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提;以提取的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PER擴(kuò)增反應(yīng),對(duì)PCR陽(yáng)性結(jié)果的重組質(zhì)粒再用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I進(jìn)行雙酶切鑒定。將鑒定正確的質(zhì)粒分別命名為pGEM-T-vvhA和pGEM-T-vvp,并進(jìn)行測(cè)序,對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析。 2.創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素vvhA及金屬蛋白酶vvp重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定: (1)原核表達(dá)載體的構(gòu)建:對(duì)重組質(zhì)粒pGEM-T-vvhA、pGEM-T-vvp及質(zhì)粒pET-32a~+用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I雙酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。切下含有目的片斷的凝膠帶后,進(jìn)行純化回收。vvp、vvhA基因片斷分別與pET-32a~+質(zhì)粒酶切片斷在T_4連接酶的作用下連接;并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)。 (2)重組質(zhì)粒的篩選和鑒定:用質(zhì)粒小提試劑盒對(duì)具有氨卞抗性的克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提;以提取的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR鑒定和以BamH I和Xho I雙酶切鑒定后,將兩種重組質(zhì)粒分別命名為pET-32a-vvhA和pET-32a-vvp。以誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)外源基因在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá),對(duì)表達(dá)產(chǎn)物作SDS-PAGE分析,將融合蛋白分別命名為rVVP及rVVC,并以抗6×His組氨酸單克隆抗體為一抗對(duì)融合蛋白的表達(dá)進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。 3.溶細(xì)胞毒素及金屬蛋白酶重組蛋白的純化及抗原性分析: (1)蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化:對(duì)蛋白表達(dá)可溶性進(jìn)行分析后針對(duì)誘導(dǎo)過程中對(duì)工程菌表達(dá)蛋白產(chǎn)生影響的4個(gè)因素:誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度以及誘導(dǎo)時(shí)搖菌的轉(zhuǎn)數(shù),運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)結(jié)果進(jìn)行直觀分析及方差分析。對(duì)實(shí)驗(yàn)得出的最佳誘導(dǎo)條件組合進(jìn)行驗(yàn)證。 (2)目的蛋白的純化、復(fù)性、濃縮、濃度測(cè)定及抗原性分析:以最佳誘導(dǎo)條件對(duì)重組工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)后,超聲破菌。融合蛋白rVVP及rVVC經(jīng)過His-Bind親和層析方法獲得純化。純化后的蛋白以透析法進(jìn)行復(fù)性和濃縮。采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。以純化后的重組蛋白為抗原,以兔抗創(chuàng)傷弧菌全菌血清為一抗,通過間接ELISA法及Western-blot檢測(cè)重組蛋白抗原性。 4.溶細(xì)胞毒素及金屬蛋白酶多克隆抗體的制備及溶細(xì)胞毒素及金屬蛋白酶致病性的研究: (1)多克隆抗體的制備:將蛋白與佐劑1:1混合后注射新西蘭大白兔,皮下多點(diǎn)注射。用免疫瓊脂雙擴(kuò)散法初步檢測(cè)抗體的滴度,當(dāng)?shù)味冗_(dá)到1:16后,頸動(dòng)脈放血,提取血清,并對(duì)免疫血清進(jìn)行效價(jià)測(cè)定及特異性檢測(cè);根據(jù)抗血清特異性檢測(cè)結(jié)果,對(duì)多抗血清進(jìn)行吸收純化,得到多克隆抗體。 (2)溶細(xì)胞毒素及金屬蛋白酶致病性的研究:昆明小鼠36只,應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成6組,每組6只,分別為溶細(xì)胞毒素注射組、金屬蛋白酶注射組、溶細(xì)胞毒素及金屬蛋白酶聯(lián)合注射組、Vv活菌注射組及對(duì)照1組、對(duì)照2組。Vv活菌注射組腹腔注射Vv菌液;對(duì)照1組腹腔注射等量的滅菌的Marinebroth 2216培養(yǎng)基;溶細(xì)胞毒素注射組及金屬蛋白酶注射組小鼠分別注射前述純化復(fù)性的rVVC及rVVP,聯(lián)合注射組小鼠注射rVVC和rVVP的混合液;對(duì)照2組尾靜脈注射等量的滅菌的透析液。隨后對(duì)小鼠一般情況進(jìn)行觀察及臟器組織的Vv分離鑒定和病理學(xué)觀察,以確定溶細(xì)胞毒素及金屬蛋白酶對(duì)各臟器組織的致病性;以所制備的多克隆抗體為一抗免疫組化法檢測(cè)組織中創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素和金屬蛋白酶的分布情況。 結(jié)果: 1.創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素vvhA基因及金屬蛋白酶vvp基因的體外擴(kuò)增、T-A克隆及序列分析: 從VvATCC27562株DNA模板中擴(kuò)增vvhA基因及vvp基因cds全長(zhǎng),均獲得與預(yù)期大小相符合的目的條帶。經(jīng)過T-A克隆得到重組質(zhì)粒pGEM-T-vvhA和pGEM-T-vvp,對(duì)其進(jìn)行測(cè)序、序列分析及比對(duì):vvp基因cds全長(zhǎng)1830bp,A、T含量分別為25.96%和24.54%,(G+C)含量占49.5%。其核苷酸序列與創(chuàng)傷弧菌E86株的vvp基因序列(GeneBank No.DQ923325)比較,同源性為99%,有17處點(diǎn)突變。其中15處為同義突變;2處為錯(cuò)義突變:vvhA基因cds全長(zhǎng)1356bp,A、T含量分別為27.65%和23.89%,(G+C)含量占48.45%。其核苷酸序列與創(chuàng)傷弧菌CDC B3547株的vvhA基因序列(GeneBank No.AB124803.1)比較,同源性為99%,有9處點(diǎn)突變并且均為同義突變。 2.創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素vvhA及金屬蛋白酶vvp重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定: 表達(dá)載體pET-32a-vvhA及pET-32a-vvp轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),均能表達(dá)融合蛋白。Western-blot免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物rVVC及rVVP均能與抗6×His組氨酸單克隆抗體特異性結(jié)合,這一結(jié)果也證實(shí)所構(gòu)建的兩種原核表達(dá)系統(tǒng)均能表達(dá)融合6×His組氨酸的蛋白。 3.溶細(xì)胞毒素金屬蛋白酶重組蛋白的純化及抗原性分析: 基于正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化融合蛋白的表達(dá)條件,對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直觀分析及方差分析均表明:各因素對(duì)rVVP表達(dá)的重要性依次為誘導(dǎo)搖菌轉(zhuǎn)數(shù)、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑IPTG濃度。本實(shí)驗(yàn)的最佳組合誘導(dǎo)條件為搖菌轉(zhuǎn)數(shù)250r/m、誘導(dǎo)時(shí)間4h、誘導(dǎo)溫度37℃、誘導(dǎo)劑IPTG濃度1mmol/L:而各因素對(duì)rVVC表達(dá)的重要性依次為誘導(dǎo)時(shí)間、搖菌轉(zhuǎn)數(shù)、誘導(dǎo)劑IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度。本實(shí)驗(yàn)的最佳搭配誘導(dǎo)條件為搖菌轉(zhuǎn)數(shù)250r/m、誘導(dǎo)時(shí)間4h、誘導(dǎo)溫度30℃、誘導(dǎo)劑IPTG濃度1mmol/L。在各自優(yōu)化的誘導(dǎo)條件下兩種蛋白均能高效表達(dá),蛋白表達(dá)量分別達(dá)到了40.67%(rVVP)及58.27%(rVVC)。通過親和層析的方法可以獲得較純的蛋白,并且兩種蛋白都具有良好的抗原性。 4.溶細(xì)胞毒素VVC及金屬蛋白酶VVP多克隆抗體的制備及其致病性研究: (1)多克隆抗體的效價(jià)及特異性檢測(cè):吸收純化后的溶細(xì)胞毒素及金屬蛋白酶多克隆抗體分別與相應(yīng)的溶細(xì)胞毒素及金屬蛋白酶均能很好地特異性結(jié)合,且與多種常見細(xì)菌菌體無交叉反應(yīng);兩種抗體的效價(jià)均達(dá)到了1:12800。 (2)腹腔注射Vv致小鼠感染后致小鼠多臟器損傷,尤以肺、肝臟、腎臟的損傷最為嚴(yán)重。肺和腎臟的損傷均以出血性病變?yōu)橹?而肝臟的損傷表現(xiàn)為肝細(xì)胞廣泛的水腫、氣球樣變性。 (3)溶細(xì)胞毒素及金屬蛋白酶對(duì)小鼠各臟器組織的致病性觀察:溶細(xì)胞毒素可導(dǎo)致小鼠肺臟的損傷,且與腹腔注射Vv致小鼠感染后肺損傷相似,以出血性病變?yōu)橹�。而金屬蛋白酶未�?duì)小鼠的各臟器組織造成明顯損傷。溶細(xì)胞毒素聯(lián)合金屬蛋白酶作用導(dǎo)致的小鼠肺損傷與溶細(xì)胞毒素單獨(dú)作用沒有差別。 (4)免疫組化檢測(cè)結(jié)果:溶細(xì)胞毒素注射組、聯(lián)合注射組及Vv活菌注射組小鼠肺組織中均檢測(cè)到了溶細(xì)胞毒素的分布:主要分布于肺支氣管上皮、肺泡上皮;以兔免疫前血清作為一抗的陰性對(duì)照組肺組織,肺支氣管上皮及肺泡上皮均為陰性結(jié)果;肝臟和腎組織中未見溶細(xì)胞毒素分布。而金屬蛋白酶注射組、聯(lián)合注射及Vv活菌注射組小鼠的各主要臟器組織中均未檢測(cè)到金屬蛋白酶的分布。 結(jié)論: 1.證實(shí)了vvp基因及vvhA基因均在創(chuàng)傷弧菌的不同菌株之間具有高度的保守性。 2.構(gòu)建了創(chuàng)傷弧菌vvp基因及vvhA基因高效原核表達(dá)系統(tǒng),得到了高純度有活性的重組蛋白rVVP和rVVC;兩種蛋白均具有良好的免疫原性,為創(chuàng)傷弧菌致病機(jī)制的研究及創(chuàng)傷弧菌免疫檢測(cè)試劑盒及疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。 3.成功制備了特異性較好的抗Vv溶細(xì)胞毒素多克隆抗體及抗Vv金屬蛋白酶多克隆抗體。 4.首次證實(shí)創(chuàng)傷弧菌感染機(jī)體時(shí),溶細(xì)胞毒素對(duì)其毒性的產(chǎn)生是必須的,溶細(xì)胞毒素可獨(dú)立發(fā)揮作用對(duì)機(jī)體造成損傷;發(fā)現(xiàn)肺臟是創(chuàng)傷弧菌感染機(jī)體時(shí)其毒力因素溶細(xì)胞毒素作用的靶器官。 5、在注射劑量為0.338mg/只的情況下,金屬蛋白酶不能獨(dú)立作用對(duì)小鼠機(jī)體組織造成損傷;金屬蛋白酶對(duì)傷弧菌毒力的產(chǎn)生可能并不是必須的。 6、溶細(xì)胞毒素和金屬蛋白酶之間不存在相互協(xié)同或抑制作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392;R378

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4 胡長(zhǎng)方;吃生蝦小心染食肉菌[N];福建科技報(bào);2007年

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6 朱為民 張萬(wàn)武;王愛民深造歸來挑大梁[N];解放軍報(bào);2000年

7 張?zhí)锟?你從哪里來 要到哪里去[N];科技日?qǐng)?bào);2002年

8 康存棟;突破我國(guó)水產(chǎn)疫苗研發(fā)和生產(chǎn)瓶頸[N];中國(guó)漁業(yè)報(bào);2008年

9 楊威;石斑魚病害的防治[N];中國(guó)海洋報(bào);2004年

10 阿娜;肌膚呵護(hù)早晚有別[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2004年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 鄭晶;創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素及金屬蛋白酶的基因克隆、蛋白表達(dá)、抗體制備及其致病性研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2008年

2 王常觀;金屬蛋白酶在外傷性視網(wǎng)膜脫離中的表達(dá)[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2002年

3 談頌;缺血性卒中出血轉(zhuǎn)化影響及預(yù)測(cè)因素的研究[D];四川大學(xué);2005年

4 王衛(wèi)明;大鼠終板軟骨細(xì)胞向髓核遷移的規(guī)律及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2005年

5 孫愛清;番茄熱誘導(dǎo)型ftsH基因的分子克隆、表達(dá)特性及生理功能[D];山東師范大學(xué);2006年

6 楊慧;鰻弧菌金屬蛋白酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)、純化、定點(diǎn)突變及其DNA疫苗的研制[D];中國(guó)海洋大學(xué);2007年

7 陳敬;VEGF在Lewis肺癌微轉(zhuǎn)移灶形成中的作用及機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

8 鐘林;血管移植后再狹窄的生物性防止及其物理性血管生成的治療策略[D];復(fù)旦大學(xué);2003年

9 薛健飛;平榛葉化學(xué)成分及其生物活性的研究[D];吉林大學(xué);2009年

10 邊斐;Thermolysin家族金屬蛋白酶的適冷機(jī)制及深海適冷菌Pseudoalteromonas sp.SM9913對(duì)有機(jī)氮的降解[D];山東大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 李永濤;創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素基因vvhA的克隆和表達(dá)[D];浙江大學(xué);2004年

2 李艷;創(chuàng)傷弧菌對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用的初步研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2010年

3 何閃閃;水產(chǎn)貝類中副溶血弧菌與創(chuàng)傷弧菌的基因檢測(cè)與分析[D];中國(guó)海洋大學(xué);2004年

4 嚴(yán)智敏;創(chuàng)傷弧菌膠體金免疫層析試紙條研制[D];南方醫(yī)科大學(xué);2011年

5 張愛忠;抗纖方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織金屬蛋白酶及其抑制因子表達(dá)的影響[D];湖北中醫(yī)學(xué)院;2003年

6 向瑞屏;a捎鎂酆廈噶詞椒碼杉際跫觳獍拿藕Ｏ恃局謝袈一【�、副霍乱弧菌及创伤弧菌[D];暨南大學(xué);2006年

7 胡細(xì)連;蝮蛇毒金屬蛋白酶的cDNA克隆及表達(dá)[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2001年

8 袁海鷹;鹿茸多肽對(duì)兔骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞金屬蛋白酶mRNA表達(dá)的影響[D];長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué);2007年

9 趙雅琳;地爾硫（艸卓）對(duì)大鼠心肌梗死后金屬蛋白酶表達(dá)的影響[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2003年

10 齊明;多西環(huán)素對(duì)鼠退變椎間盤中金屬蛋白酶抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2007年

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本文編號(hào)：1647586