本文選題：S-腺苷同型半胱氨酸水解酶　切入點(diǎn)：SDS-PAGE電泳　出處：《中南大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的：為了獲得高純度有活性的SAHH,本實(shí)驗(yàn)在表達(dá)載體PQE30轉(zhuǎn)化菌株E.coli BL21(DE3)成功構(gòu)建的基礎(chǔ)上,通過大量培養(yǎng)該菌來表達(dá)SAHH,利用層析方法來純化SAHH,建立一套完整的純化方案,并初步探討其在生化試劑方面的應(yīng)用。 方法：1.在37℃以及搖床轉(zhuǎn)速200rpm用1L LB肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)E.coli BL21(DE3),培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(OD600值約0.5),加入IPTG至濃度為0.5mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)SAHH,誘導(dǎo)時(shí)間10h。 2.采用勻漿法裂解細(xì)菌,通過硫酸銨分級(jí)沉淀得到蛋白酶SAHH的粗制品,再經(jīng)Sepharose CL-6B Fast Flow、DEAE Sepharose Fast Flow以及Sephadex G-75層析柱進(jìn)行細(xì)分離。 3.采用SDS-PAGE電泳和蛋白免疫印跡技術(shù)鑒定表達(dá)及純化產(chǎn)物。 4.根據(jù)循環(huán)酶法測(cè)定Hcy的原理,相同條件下用已知試劑和替代試劑分別檢測(cè)相同血清中Hcy含量,并采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)比較差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：1.E.coli BL21(DE3)在37℃、搖床轉(zhuǎn)速200rpm、IPTG濃度為0.5mmol/L以及誘導(dǎo)10h的條件下成功表達(dá)SAHH。 2.利用層析技術(shù)純化SAHH,獲得SDS-PAGE電泳近乎單一蛋白,提純的酶制劑進(jìn)行電泳后實(shí)施PVDF轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)也是單一條帶。 3.通過比較已知試劑和替代試劑檢測(cè)相同血清中的Hcy含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)p0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：1.用經(jīng)典的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)SAHH,表達(dá)穩(wěn)定,操作簡(jiǎn)便,污染小。 2.本研究成功地分離純化SAHH,整個(gè)提純過程中SAHH較穩(wěn)定,無降解。 3.本研究初步證實(shí)純化的SAHH具有一定的活性,在生化試劑應(yīng)用上有一定的價(jià)值。
[Abstract]:Objective: in order to obtain the high purity and activity SAHH, the recombinant plasmid E. coli BL21DE3 was successfully constructed. The strain was cultured in large quantities to express SAHH, and then purified by chromatography, and a complete purification scheme was established. Its application in biochemical reagents was also discussed. Methods at 37 鈩，

本文編號(hào)：1644269