本文選題：組織工程　切入點(diǎn)：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 在組織工程瓣膜(tissue engineering heart valve,TEHV)的研究過程中,如何短時(shí)間獲取大量功能狀態(tài)良好的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs),維持MSCs的原始狀態(tài),及控制MSCs分化方向是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。影響MSCs生長、功能狀態(tài)及分化的因素很多,包括O2濃度、PH值、溫度、生長因子、血清、培養(yǎng)基、剪切力、細(xì)胞密度等。微環(huán)境中O2濃度及PH值是非常重要因素:O2對(duì)MSCs的影響是多個(gè)方面的,適當(dāng)?shù)腛2濃度可以促進(jìn)MSCs的增殖、分化、原始狀態(tài)的維持; MSCs對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的PH值的變化非常敏感,不同PH值對(duì)MSCs的增殖、分化及生物學(xué)功能有著顯著影響。目前傳統(tǒng)的細(xì)胞體外培養(yǎng)環(huán)境中O2濃度約為21%,CO2濃度約為5%,所用培養(yǎng)基PH值為7.2~7.4。而人體正常組織和組織間隙中的O2濃度3% ~ 9%,骨髓腔內(nèi)O2濃度1%~7%;動(dòng)脈血CO2濃度約5% ,靜脈血CO2濃度約6% ,骨髓腔內(nèi)CO2濃度約7%;人體動(dòng)靜脈血液及骨髓腔內(nèi)pH值恒定在7.20～7.50間。目前,低氧環(huán)境能顯著影響干細(xì)胞的增殖和生長因子的分泌,但未見低氧對(duì)種子細(xì)胞黏附功能影響的研究報(bào)道。為此,我們分別采用6% O2的培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)MSCs,探討低氧環(huán)境對(duì)MSCs增殖功能及粘附功能影響。同時(shí)針對(duì)傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)液如DMEM, DF-12, M199等均隨著使用或存放時(shí)間的延長,培養(yǎng)液的pH值會(huì)明顯升高,我們首次嘗試7%CO2環(huán)境來增強(qiáng)培養(yǎng)液中CO2/HCO3-緩沖能力,穩(wěn)定培養(yǎng)液pH值,探討此種穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境對(duì)MSCs增殖及細(xì)胞原始狀態(tài)的影響,旨在探索合適的細(xì)胞培養(yǎng)的條件。 第一部分:小鼠MSCs細(xì)胞分離、純化、擴(kuò)增并鑒定:經(jīng)Percoll密度梯度離心和貼壁生長的方法從采集的小鼠骨髓液中提取,倒置顯微鏡觀察其形態(tài),通過免疫組化及流式細(xì)胞儀來進(jìn)行鑒定。結(jié)果:選取的6個(gè)培養(yǎng)瓶的小鼠MSCs,進(jìn)行免疫組化染色顯示:ɑ-SMA, Vimentin均呈陽性表達(dá);小鼠MSCs流式細(xì)胞儀鑒定示:CD29, CD44, CD90及CD105呈現(xiàn)高度陽性表達(dá),陽性率分別為92.7%,99.6%,99.5%及99.4%,而CD34和CD45陽性表達(dá)率僅分別為4.6%和3.2%。結(jié)果表明經(jīng)此種方法分離純化而來的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 第二部分:6% O2與21% O2條件下小鼠MSCs增殖、粘附及細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)量的比較:兩組間各挑選生長良好的3代對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,一共分為6個(gè)對(duì)照組,分別進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn),粘附實(shí)驗(yàn),及通過Western- blotting測(cè)定FN及VN的表達(dá),初步評(píng)價(jià)兩種不同O2環(huán)境下MSCs的增殖、分泌及粘附功能狀態(tài)。結(jié)果:6% O2條件下培養(yǎng)的小鼠MSCs較21%O2有更強(qiáng)的增殖能力(p0.05)、粘附能力(p0.05)及分泌功能(p0.05); 第三部分:7% CO2與5% O2條件下小鼠MSCs增殖能力及OCT-4蛋白表達(dá)量的比較:兩組間各挑選生長良好的3代對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,一共分為6個(gè)對(duì)照組,分別進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn),及通過Western-blotting測(cè)定OCT-4蛋白的表達(dá),初步評(píng)價(jià)兩種不同CO2環(huán)境下MSCs的增殖及干細(xì)胞原始狀態(tài)的維持。結(jié)果:7% CO2條件下培養(yǎng)的小鼠MSCs較5% CO2有更強(qiáng)的增殖能力(P0.05);同時(shí)OCT-4蛋白的表達(dá)含量也較高,表明7% CO2條件更有利于小鼠MSCs原始狀態(tài)的維持(P0.05); 第四部分:7%CO2 +6% O2與5%CO2 +6% O2條件下小鼠MSCs增殖、粘附及原始狀態(tài)維持的比較:兩組間各挑選生長良好的3代對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,一共分為6個(gè)對(duì)照組,分別進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn),粘附實(shí)驗(yàn),及通過Western- blotting測(cè)定FN及OCT-4的表達(dá),初步評(píng)價(jià)兩種不同氣體環(huán)境下MSCs的增殖、粘附功能及原始狀態(tài)維持。結(jié)果:7%CO2 +6% O2條件下培養(yǎng)的小鼠MSCs較5%CO2 +6% O2有更強(qiáng)的增殖能力(P0.05)及粘附能力(P0.05),同時(shí)OCT-4的表達(dá)更高(p0.05); 結(jié)論:O2和PH值是細(xì)胞生長的重要的微環(huán)境,對(duì)MSCs的增殖、分化有著重要影響。通過模擬生物體內(nèi)微環(huán)境來進(jìn)行MSCs的體外培養(yǎng),有利于快速獲取理想的質(zhì)和量的種子細(xì)胞,對(duì)組織工程的研究有著積極的意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R329

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