本文選題：單純皰疹病毒2型　切入點：開放讀碼框2　出處：《華南理工大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 單純皰疹病毒Ⅱ型(Herpes Simplex VirusⅡ,HSV-2)感染主要引起生殖器皰疹(genital herpes.GH)。具有潛在致癌性,孕婦感染易引起胎兒早產(chǎn),夭折。近年來GH發(fā)病率明顯上升,是當前全球范圍內(nèi)對人類健康危害較嚴重的性傳播疾病。HSV-2感染后,感染者終生攜帶病原體,并以潛伏感染的形式局限在感覺神經(jīng)后根。該病易復(fù)發(fā),目前尚無徹底治愈的方法。由于對其潛伏復(fù)發(fā)的機理尚不明確,給臨床上徹底清除病毒帶來了巨大困難。 潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄子(Latency Associated transcript,LAT)是HSV在潛伏期間唯一大量存在和被轉(zhuǎn)錄的基因,被認為在HSV-2潛伏的建立、維持及激活中起著至關(guān)重要的作用。HSV-2的LAT能編碼生成9.0Kb的非主要LAT和2.2Kb主要LAT,LAT功能的研究主要集中于對2.2kb主要LAT上,它包含三個開放讀碼框(Open Reading Frame,ORF)。對于LAT的作用機理,有假說指出LAT通過抗神經(jīng)元凋亡而發(fā)揮潛伏復(fù)活功能。 本研究從已成功構(gòu)建的pVAX-LAT重組載體中克隆抗凋亡可能相關(guān)基因ORF2,構(gòu)建具有綠色熒光標簽的重組表達質(zhì)粒pEGFP-ORF2。研究其在SH-SY5Y和Vero細胞的表達,及對Vero細胞的生物學(xué)作用。 首先,根據(jù)GenBank中LAT ORFs的核苷酸序列設(shè)計引物,從已成功構(gòu)建的pVAX-LAT重組載體中特異性擴增HSV-2 LAT ORF2片段,將其與真核表達載體pEGFP-C2在體外重組,經(jīng)單雙酶切和測序鑒定,獲得重組真核表達質(zhì)粒pEGFP-ORF2。 將重組真核表達質(zhì)粒pEGFP-ORF2轉(zhuǎn)染SH-SY5Y/Vero細胞,熒光顯微鏡檢測到ORF2與綠色熒光蛋白的融合表達,RT-PCR檢測到ORF2的mRNA表達。G418篩選20天后得到了穩(wěn)定表達EGFP-ORF2的Vero細胞株。 重組表達質(zhì)粒pEGFP-ORF2轉(zhuǎn)染Vero細胞,熒光顯微鏡觀察到HSV-2 LAT ORF2誘導(dǎo)細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,綠色熒光蛋白在細胞的定位也發(fā)生了改變,MTT法檢測到細胞活性降低�？梢奌SV-2 LAT ORF2對細胞有損傷作用。但5-FU誘導(dǎo)細胞凋亡后,通過熒光顯微鏡和Giemsa染色觀察細胞形態(tài)與陽性對照相同, MTT法分析活性率與正常無差異而顯著高于陰性對照, DNA ladder未見凋亡條帶。Caspase-3活性檢測顯著低于對照組。由此我們認為HSV-2 LAT ORF2基因在Vero細胞中具有抗5-FU誘導(dǎo)的凋亡作用。 本研究成功構(gòu)建了pEGFP- ORF2重組質(zhì)粒,并在SH-SY5Y/Vero細胞內(nèi)得到有效表達。同時檢測了pEGFP- ORF2對Vero細胞的生物學(xué)作用,揭示了其抗凋亡的特性,為進一步研究LAT介導(dǎo)的潛伏復(fù)發(fā)機制奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Herpes Simplex Virus 鈪，

本文編號：1582788