本文選題：單純皰疹病毒2型　切入點(diǎn)：開放讀碼框2　出處：《華南理工大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 單純皰疹病毒Ⅱ型(Herpes Simplex VirusⅡ,HSV-2)感染主要引起生殖器皰疹(genital herpes.GH)。具有潛在致癌性,孕婦感染易引起胎兒早產(chǎn),夭折。近年來(lái)GH發(fā)病率明顯上升,是當(dāng)前全球范圍內(nèi)對(duì)人類健康危害較嚴(yán)重的性傳播疾病。HSV-2感染后,感染者終生攜帶病原體,并以潛伏感染的形式局限在感覺(jué)神經(jīng)后根。該病易復(fù)發(fā),目前尚無(wú)徹底治愈的方法。由于對(duì)其潛伏復(fù)發(fā)的機(jī)理尚不明確,給臨床上徹底清除病毒帶來(lái)了巨大困難。 潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄子(Latency Associated transcript,LAT)是HSV在潛伏期間唯一大量存在和被轉(zhuǎn)錄的基因,被認(rèn)為在HSV-2潛伏的建立、維持及激活中起著至關(guān)重要的作用。HSV-2的LAT能編碼生成9.0Kb的非主要LAT和2.2Kb主要LAT,LAT功能的研究主要集中于對(duì)2.2kb主要LAT上,它包含三個(gè)開放讀碼框(Open Reading Frame,ORF)。對(duì)于LAT的作用機(jī)理,有假說(shuō)指出LAT通過(guò)抗神經(jīng)元凋亡而發(fā)揮潛伏復(fù)活功能。 本研究從已成功構(gòu)建的pVAX-LAT重組載體中克隆抗凋亡可能相關(guān)基因ORF2,構(gòu)建具有綠色熒光標(biāo)簽的重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-ORF2。研究其在SH-SY5Y和Vero細(xì)胞的表達(dá),及對(duì)Vero細(xì)胞的生物學(xué)作用。 首先,根據(jù)GenBank中LAT ORFs的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物,從已成功構(gòu)建的pVAX-LAT重組載體中特異性擴(kuò)增HSV-2 LAT ORF2片段,將其與真核表達(dá)載體pEGFP-C2在體外重組,經(jīng)單雙酶切和測(cè)序鑒定,獲得重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-ORF2。 將重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-ORF2轉(zhuǎn)染SH-SY5Y/Vero細(xì)胞,熒光顯微鏡檢測(cè)到ORF2與綠色熒光蛋白的融合表達(dá),RT-PCR檢測(cè)到ORF2的mRNA表達(dá)。G418篩選20天后得到了穩(wěn)定表達(dá)EGFP-ORF2的Vero細(xì)胞株。 重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-ORF2轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察到HSV-2 LAT ORF2誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,綠色熒光蛋白在細(xì)胞的定位也發(fā)生了改變,MTT法檢測(cè)到細(xì)胞活性降低�？梢�(jiàn)HSV-2 LAT ORF2對(duì)細(xì)胞有損傷作用。但5-FU誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后,通過(guò)熒光顯微鏡和Giemsa染色觀察細(xì)胞形態(tài)與陽(yáng)性對(duì)照相同, MTT法分析活性率與正常無(wú)差異而顯著高于陰性對(duì)照, DNA ladder未見(jiàn)凋亡條帶。Caspase-3活性檢測(cè)顯著低于對(duì)照組。由此我們認(rèn)為HSV-2 LAT ORF2基因在Vero細(xì)胞中具有抗5-FU誘導(dǎo)的凋亡作用。 本研究成功構(gòu)建了pEGFP- ORF2重組質(zhì)粒,并在SH-SY5Y/Vero細(xì)胞內(nèi)得到有效表達(dá)。同時(shí)檢測(cè)了pEGFP- ORF2對(duì)Vero細(xì)胞的生物學(xué)作用,揭示了其抗凋亡的特性,為進(jìn)一步研究LAT介導(dǎo)的潛伏復(fù)發(fā)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Herpes Simplex Virus 鈪，

本文編號(hào)：1582788