本文選題：滇南小耳豬　切入點(diǎn)：BMSCs　出處：《昆明醫(yī)學(xué)院》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 第一部分滇南小耳豬BMSCs體外培養(yǎng)與鑒定 [目的]找到滇南小耳豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)高效擴(kuò)增的方法,以更好地獲取軟骨組織工程種子細(xì)胞。 [方法]用骨穿針抽取滇南小耳豬骨髓,采用離心加貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)原代、第一代、第二代BMSCs的表面標(biāo)志物CD29、CD4、CD45。并取第二代BMSCs作成骨和成軟骨誘導(dǎo),用茜蘇紅、Von kossa染色法檢測(cè)成骨方向分化的能力,Western blot檢測(cè)成軟骨分化的能力。 [結(jié)果](1)細(xì)胞形態(tài)均為梭形生長(zhǎng),呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。(2)流式細(xì)胞檢測(cè)P_0CD29陽性率為73.10%,P_0CD44陽性率為69.74%,P_0CD45陰性率為99.68%。P_1CD29陽性率為99.44%,P_1CD44陽性率為99.96%,P_1CD45陰性率為95.81%。P_2CD29陽性率為99.49%,P_2CD44陽性率為99.52%,P_2CD45陰性率為99.93%。(3) BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)三周后茜蘇紅染色、Von kossa染色均為陽性。(4) BMSCs經(jīng)軟骨誘導(dǎo)三周后Western blot檢測(cè)Ⅱ膠原陽性。 [結(jié)論](1)采用離心加貼壁法培養(yǎng)滇南小耳豬BMSCs是一種高效擴(kuò)增的方法。(2)第二代滇南小耳豬BMSCs純度高,可作為組織工程種子細(xì)胞。(3)第二代滇南小耳豬BMSCs有多分化潛能,且能向軟骨分化,適合作軟骨組織工程種子細(xì)胞。 第二部分rAd5-BMP2-EGFP和rAd5-TGFβ3載體的構(gòu)建 [目的]構(gòu)建rAd5-BMP2-EGFP和rAd5-TGFβ3轉(zhuǎn)染載體。 [方法]PCR擴(kuò)增BMP2基因；連接PCR產(chǎn)物至T載體中并送交測(cè)序；BamHI、EcoRI雙酶切鑒定；亞克隆BMP2至穿梭載體PEC3.1-GIE上；通過LR體外同源重組將BMP2表達(dá)框轉(zhuǎn)移至pGSadeno腺病毒表達(dá)載體上,包裝重組腺病毒。熒光顯微鏡證實(shí)rAd5-BMP2-EGFP載體構(gòu)建成功,并測(cè)定病毒滴度。PCR擴(kuò)增TGFβ3基因；連接PCR產(chǎn)物至T載體中并送交測(cè)序；BamHI、EcoRI雙酶切鑒定；亞克隆TGFβ3至穿梭載體PEC3.1上；通過LR體外同源重組將TGFβ3表達(dá)框轉(zhuǎn)移至pGSadeno腺病毒表達(dá)載體上,包裝重組腺病毒。PCR驗(yàn)證rAd5-TGFβ3載體構(gòu)建成功,并測(cè)定病毒滴度。 [結(jié)果](1)PCR擴(kuò)增BMP2基因大小為1.2k。(2)連接PCR產(chǎn)物至T載體中并送交測(cè)序沒有堿基發(fā)生突變,無丟失和增加。(3)BamHI、EcoRI雙酶切BMP2T載體大小為1.2k.(4)PCR鑒定BMP2 pGSadeno腺病毒表達(dá)載體可見1.2k條帶。(5)第三輪病毒滴度109pfu/ml,并可以看到明顯綠色熒光。(6)PCR擴(kuò)增TGFβ3基因大小為930 bp。(7)連接PCR產(chǎn)物至T載體中并送交測(cè)序沒有堿基發(fā)生突變,無丟失和增加。(8) BamHI、EcoRI雙酶切TGFβ3T載體大小為930 bp。(9)PCR鑒定TGFβ3 pGSadeno腺病毒表達(dá)載體可見930 bp條帶。(10)第三輪病毒滴度109pfu/ml,PCR鑒定可見514bp條帶。 [結(jié)論]成功構(gòu)建出rAd5-BMP2-EGFP和rAd5-TGFβ3載體。 第三部分rAd5-BMP2和rAd5-TGFβ3誘導(dǎo)滇南小耳豬BMSCs向軟骨分化 [目的]將rAd5-BMP2和rAd5-TGFβ3轉(zhuǎn)染到滇南小耳豬BMSCs并檢測(cè)其在BMSCs中的表達(dá),觀察雙基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)BMSCs向軟骨分化的作用。 [方法]將rAd5-BMP2-EGFP單獨(dú)轉(zhuǎn)染、rAd5-BMP2-EGFP和rAd5-TGFβ3共同轉(zhuǎn)染到第二代滇南小耳豬BMSCs中,流式檢測(cè)1、2、3、4天熒光表達(dá)率將rAd5-BMP2和rAd5-TGFβ3共同轉(zhuǎn)染、HK(空病毒載體)單獨(dú)轉(zhuǎn)染到第二代滇南小耳豬BMSCs中及和正常細(xì)胞同時(shí)培養(yǎng),觀察細(xì)胞形態(tài),分別于7、21天取出細(xì)胞行Western blot檢測(cè)BMP2和TGFβ3,三周取出細(xì)胞行Western blot檢測(cè)Ⅱ膠原。 [結(jié)果]流式檢測(cè)rAd5-BMP2-EGFP轉(zhuǎn)染組1、2、3、4天熒光陽性率分別為28.15%、77.84%、81.57%、84.86%; rAd5-BMP2-EGFP和rAd5-TGFβ3轉(zhuǎn)染組1、2、3、4天熒光轉(zhuǎn)染率分別為19.80%、35.26%、78.62%、77.27%。rAd5-BMP2和rAd5-TGFβ3同時(shí)轉(zhuǎn)染滇南小耳豬BMSCsWestern blot檢測(cè)BMP2和TGFβ3呈陽性,Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染rAd5-BMP2和rAd5-TGFβ3三周后滇南小耳豬BMSCs的Ⅱ膠原呈陽性。 [結(jié)論](1)rAd5-BMP2和rAd5-TGFβ3可同時(shí)轉(zhuǎn)染滇南小耳豬BMSCs并有效表達(dá),轉(zhuǎn)染效率在72小時(shí)最佳。 (2)BMP2和TGFβ3可誘導(dǎo)滇南小耳豬BMSCs向軟骨分化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：1582980