本文選題：志賀菌屬　切入點：多重耐藥　出處：《鄭州大學》2010年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：志賀菌屬(Shigella)是感染性腹瀉的重要病原,它引起的細菌性痢疾(菌痢)發(fā)病率在我國居傳染病發(fā)病率的前三位,是我國傳染病防治工作的重點。抗生素應用于臨床治療菌痢歷史已久,不僅可以減輕病情、縮短病程,還能減少病人排菌,避免進一步傳播。然而隨著抗生素的廣泛使用,臨床頻繁出現耐藥志賀菌屬菌株,而且呈現為多重耐藥(multi-drug resistance, MDR)。多重耐藥志賀菌引起的感染不僅在發(fā)展中國家,在發(fā)達國家也成為影響臨床治療的關鍵因素。多重耐藥志賀菌屬不僅給細菌性痢疾的防治帶來新的挑戰(zhàn),對細菌耐藥性的傳播也產生重要影響。因此,志賀菌屬細菌的多重耐藥問題和耐藥機制引起了人們的廣泛關注。 志賀菌屬獲得某種抗生素抗性主要通過兩種機制,一是細菌自身染色體基因發(fā)生突變,如抗生素靶位點的突變、調控基因突變引起膜蛋白表達的異�；蛑鲃恿鞒霰孟到y(tǒng)的激活等,使細菌對抗生素從敏感變成抗性；另一機制則是細菌從外部獲得耐藥基因,即耐藥基因的水平轉移,這是目前人們認為臨床多重耐藥株產生的主要原因。許多可移動基因單元如質粒、轉座子等,攜帶抗生素耐藥基因,使得耐藥基因在細菌屬、種、株間傳播,加快了耐藥菌株的形成。近年發(fā)現整合子系統(tǒng)參與耐藥基因的傳播。整合子包括整合酶、基因盒和特異性重組位點,整合酶可以不斷地從周圍環(huán)境捕獲耐藥基因盒或從整合子上切除基因盒。整合子作為一種遺傳元件,它自己不能自由移動,但它可以位于質粒、轉座子或者染色體上,通過其他可移動元件,整合子促進了耐藥基因的擴散,自身的廣泛分布與腸道菌多重耐藥性的形成有關。研究表明,含有整合子的細菌菌株比不含有整合子的菌株更多的顯示出對不同抗生素的耐藥性,整合子—基因盒系統(tǒng)與志賀菌屬多重耐藥性有關。國內外對志賀菌屬整合子的研究發(fā)現多重耐藥志賀菌攜帶2類整合子多見,而1類整合子檢出率相對較低。對于耐藥基因盒類型而言,在志賀菌屬中發(fā)現的類型相對較單一。不論整合子的類型還是攜帶耐藥基因盒的種類,都與志賀菌屬菌株的多重耐藥表型沒有一一對應關系。因此,探索整合子-耐藥基因盒系統(tǒng)與志賀菌屬多重耐藥的關系、評價其在志賀菌屬細菌多重耐藥機制中的作用和地位是十分必要的。 本研究對臨床分離的83株福氏志賀菌和7株宋內志賀菌進行抗生素敏感性測定,比較不同類型整合子及耐藥基因盒在志賀菌屬的分布、構成差異,并對典型整合子-耐藥基因盒系統(tǒng)進行克隆和功能分析,以期了解整合子-耐藥基因盒系統(tǒng)與志賀菌屬多重耐藥性之間的關系、正確評價整合子-耐藥基因盒系統(tǒng)在志賀菌屬多重耐藥機制中的作用和地位。 方法 1藥敏實驗 用紙片擴散法(disc diffusion test)測定所有菌株對以下抗生素藥敏紙片的抑菌環(huán)：氨芐青霉素(AMP)、四環(huán)素(TET)、甲氧芐啶/磺胺甲VA唑(SXT)、氯霉素(CHL)、萘啶酸(NAL)、環(huán)丙沙星(CIP)、慶大霉素(GEN)和頭孢唑林(CFZ)。采用瓊脂稀釋法測定以下抗生素的最低抑菌濃度(minimum inhibition concentration, MIC):TET、AMP、CHL、CIP、鏈霉素(STR)、甲氧芐啶(TMP)和磺胺異VA唑(SSS)。 2 PCR方法檢測整合子的整合酶基因PCR-RFLP分析整合子的可變區(qū)基因 分別針對1、2、3類整合子的整合酶基因設計引物,煮沸法提取菌株總DNA進行PCR擴增檢測整合酶基因。用試劑盒分別提取菌株的基因組DNA和質粒DNA,分別用針對典型1類整合子的可變區(qū)引物hep58-hep59.針對非典型1類整合子的可變區(qū)引物hep58-ISVR、針對2類整合子的可變區(qū)引物hep74-hep51,進行整合子的可變區(qū)基因PCR擴增檢測。選用合適的限制性內切酶,對得到相同長度大小的PCR產物進行RFLP (restrictive fragment length polimorphism)分析,得到相同內切酶圖譜的片段被認為是序列相同的片段。 3 Southern雜交 按Roche公司地高辛標記和檢測試劑盒(Dig DNA Labeling and Dection)的操作說明書進行操作。首先將整合酶基因intI 1和intI 2的PCR產物經凝膠回收純化后定量,用隨機引物法獲得地高辛標記探針。將提取的細菌基因組DNA分用BamHI、PstI雙酶切,將酶切產物和質粒DNA分別進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳。用毛細管虹吸法將瓊脂糖凝膠中的DNA轉移至尼龍膜,120℃烤箱干烤0.5h,將DNA固定于尼龍膜。經過預雜交、探針雜交、洗膜、避光顯色等步驟,照相記錄結果。 4質粒接合傳遞實驗 以E. coli DH5a空菌為受體,以90株志賀菌為供體分別進行。分別挑取純化的供體菌、受體菌單個菌落用LB液體培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)過夜,10倍稀釋入2 ml新鮮的LB液體培養(yǎng)基,連續(xù)37℃振蕩培養(yǎng)1-3 h使得OD600值約為0.6左右。吸取供體菌、受體菌各100μl于1 ml的新鮮LB液體培養(yǎng)基中,于37℃靜止培養(yǎng)16-18h,劃線接種于麥康凱固體培養(yǎng)基平板,37℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)16-18h。觀察菌落形態(tài),在無色半透明菌落中夾雜的紅色菌落即為接合子,挑取單一的紅色菌落接種LB液體培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng)過夜。再次劃線接種麥康凱固體培養(yǎng)基平板,37℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)16-18h后觀察形態(tài)以再次確認。提取質粒DNA,進行瓊脂糖水平凝膠電泳檢測。對獲得確認的接合子進行紙片法藥敏試驗。 5整合子-耐藥盒基因的序列測定和系統(tǒng)發(fā)生分析 針對典型1類整合子整合酶和可變區(qū)整個區(qū)域、非典型1類整合子的可變區(qū)區(qū)域、2類整合子整合酶和可變區(qū)整個區(qū)域分別進行PCR擴增,PCR產物測序后采用Blastn軟件檢索Genbank數據庫,進行序列的同源性比較和分析。從所有識別度在99%-100%的序列中,選取來自不同菌綱、菌目和菌屬的多個序列,用ClustalX軟件對核苷酸序列進行多重序列比較,用MEGA 4.1軟件作系統(tǒng)進化樹分析。構建方法分別選擇基于距離的鄰近法(neighbor joining, NJ)和最大簡約法(maximum parsimony, MP)。兩種方法均選擇了Bootstrap法進行進化樹的驗證分析。 6整合子-耐藥盒基因的克隆及克隆子的功能分析 選擇典型菌株,用PCR方法分別擴增位于可接合傳遞質粒上的典型1類整合子耐藥基因盒基因pvl、位于基因組DNA上的2類整合子耐藥基因盒基因pv2和整個2類整合子基因intI2pv2,分別將它們與克隆載體puc18連接,轉化大腸桿菌DH5a,提取質粒酶切并進行特異PCR鑒定陽性克隆子。分別檢測陽性克隆puc-pv1和puc-pv2對抗生素的最低抑菌濃度(minimum inhibition concentration, MIC)。分別用陽性克隆puc-intI2pv2和DH5a空菌作為受體菌,與供體菌志賀菌05100進行質粒接合傳遞實驗,比較耐藥性傳遞情況。 7多重耐藥志賀菌的無抗生素壓力連續(xù)傳代實驗 對耐藥譜不同的、攜帶整合子不同的10株福氏志賀菌,進行無抗生素的多次傳代培養(yǎng)。將所選菌株挑單個菌落經LB肉湯過夜增菌后,1：100倍LB肉湯稀釋,繼續(xù)37℃,200rpm振蕩培養(yǎng)3-4h,至OD600值約為0.08-0.12之間后,繼續(xù)1：100倍LB肉湯稀釋37℃,200rpm振蕩培養(yǎng)3-4h后,再次繼續(xù)1：100倍LB肉湯稀釋37℃,200rpm振蕩過夜培養(yǎng)。如此1日3次,連續(xù)培養(yǎng)10日。在此期間,每隔5次傳代就進行菌株的分離,并進行MIC的藥敏實驗和整合子的PCR檢測。 結果 1志賀菌屬耐藥性和整合子分布的檢測 90株志賀菌(83株福氏志賀菌,7株宋內志賀菌)對TET、NAL、AMP、SXT和CHL的耐藥率較高,分別為93.3%、92.2%、91.1%、82.2%和75.6%；多重耐藥率達95.6%(86/90),最常見的耐藥譜為AMP-TET-SXT-CHL-NAL(31/90,34.4%)。整合酶基因陽性率為87.8%(79/90),其中intI1單獨陽性率3.3%；intI2單獨陽性率10%；intI1和intI2同時陽性率為74.4%,3類整合子整合酶基因未檢出。多重耐藥菌的整合酶陽性率89.5%(77/86)。intI2陽性率在多重耐藥株和非多重耐藥株中分布差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。 2志賀菌屬中整合子-耐藥基因盒的特征分析 共發(fā)現4種整合子耐藥基因盒,序列提交Genbank獲得登錄號分別為FJ895301、FJ895302、GQ214137和EF634237。56株多重耐藥志賀菌同時攜帶3種整合子-耐藥基因盒系統(tǒng)：位于可接合傳遞質粒上的典型1類整合子耐藥基因盒dfrA17-aadA5或dfrA12-orfF-adA2、位于染色體DNA上的非典型1類整合子耐藥基因盒blaoxa-30-aadA1和位于染色體DNA上的2類整合子耐藥基因盒dfrA1-sat1-aadA1 非典型1類整合子耐藥基因盒l(wèi)aoxa-3o-aadAl在對AMP-TET-CHL聯合耐藥菌中的陽性率高于非聯合耐藥菌,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05) 3志賀菌屬整合子-耐藥基因盒的序列測定和系統(tǒng)發(fā)生分析 序列分析和系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現,除整合酶基因intll和非典型1類整合子耐藥基因盒blaoxa-30-aadA1外,1類整合子耐藥基因盒dfra17-aadA5、dfaA12-orf-aadA2以及2類整合子整合酶intI2基因、耐藥基因盒dfrAl-satl-aadAl都存在基因分化現象。 4志賀菌屬整合子-耐藥基因盒的克隆及克隆子功能分析 1類整合子耐藥基因盒dfrA17-aadA5陽性克隆使DH5a對STR的MIC從0.5μg/ml提高至4μg/ml,對TMP的MIC從2μg/ml提高至64μg/ml。2類整合子耐藥基因盒dfrA1-Sat1-aadA1陽性克隆使DH5a對STR的MIC從0.5μghn1提高至32μg/ml,對TMP的MIC從2μg/ml提高至64pg/ml。 通過質粒接合傳遞實驗,來自志賀菌05100含有1類整合子耐藥基因盒dfrA17-aadA5的質粒未對受體菌DH5a的抗生素敏感性產生影響,而來自志賀菌06208含有1類整合子耐藥基因盒dfrA12-orf-aandA2的質粒使得受體菌DH5a獲得對SXT和AMP的耐藥性。對于相同供體菌福氏志賀菌05100而言,含有2類整合子克隆的大腸桿菌,與大腸桿菌空菌一樣,經質粒接合傳遞后,多種抗生素的MIC并無變化。 5多重耐藥志賀菌的無抗生素壓力連續(xù)傳代實驗 無抗生素壓力的連續(xù)30次傳代實驗發(fā)現：志賀菌05015、05105、06208分別丟失了對CHL、SXT和CIP的單一耐藥性,其整合子-耐藥基因盒系統(tǒng)無變化；志賀菌06218丟失了原有的全部耐藥性(TXT.SXT和AMP),同時其僅有的位于基因組上的2類整合子-耐藥基因盒系統(tǒng),即intl2基因以及耐藥基因盒dfrA1-Snt1-aadA1,也發(fā)生了丟失。 結論 1.志賀菌屬細菌對常用抗生素普遍耐藥,多重耐藥現象嚴重(95.6%)。intl2基因陽性與志賀菌屬多重耐藥有關；非典型1類整合子耐藥基因盒blaoxa-30-aadA1陽性與志賀菌屬AMP-TET-CHL聯合耐藥有關。 2.首次報道多重耐藥志賀菌可同時攜帶3種不同整合子-耐藥基因盒：位于可接合傳遞質粒上的典型1類整合子、位于染色體上的非典型1類整合子和2類整合子。 3.來自不同菌屬的整合酶基因和耐藥基因盒在系統(tǒng)發(fā)生方面存在不同程度的分化。 4.志賀菌屬整合子攜帶的耐藥基因盒僅針對特定抗生素產生特異性耐藥,不同耐藥基因盒致耐藥程度不一。 5.志賀菌屬含整合子的質粒可接合傳遞與整合子無關的其他抗生素耐藥性。 6.志賀菌屬2類整合子-耐藥基因盒系統(tǒng)可能通過參與其他基因元件的移動和活動,來參與多個耐藥基因結構的聚集或切除,從而與志賀菌屬的多重耐藥表型之間產生復雜的間接關聯。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R378

【引證文獻】

相關碩士學位論文 前1條

1 高冬生;61株鴨源雞桿菌部分耐藥基因及其與耐藥性關系的研究[D];河南農業(yè)大學;2011年

，

本文編號：1581994