本文選題：丙型　切入點：肝炎　出處：《中國疾病預防控制中心》2010年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 丙型肝炎是一種嚴重威脅人類生命健康和生活質(zhì)量的傳染性疾病,急性丙型肝炎患者的臨床表現(xiàn)包括：乏力,食欲不振,肝臟腫大和叩擊痛,部分病人可出現(xiàn)黃疸。這一疾病的致病原為丙型肝炎(丙肝)病毒(hepatitis C virus, HCV),屬于黃病毒科丙型肝炎病毒屬,它的基因組由一條單鏈正義RNA構(gòu)成,全長約9600nt,只含有單一的開放讀碼框架,編碼3011個氨基酸組成的聚合蛋白,該聚合蛋白在翻譯的過程中或者翻譯后被宿主和病毒蛋白酶切割成至少10種成熟的結(jié)構(gòu)蛋白以及非結(jié)構(gòu)蛋白,包括：核心蛋白C, El, E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A和NS5B。 據(jù)WHO的統(tǒng)計資料表明,目前全世界約有1.7億HCV感染者,并且每年新增感染者達300萬～400萬,所以,研制和開發(fā)HCV疫苗來預防HCV感染是當前全世界所共同面臨的一個重大而且緊迫的難題。然而迄今為止尚無高效完善的HCV組織培養(yǎng)系統(tǒng),致使傳統(tǒng)減毒疫苗或者滅活疫苗的研制策略困難重重,因此關于HCV疫苗的研究主要集中在HCV重組亞單位蛋白的免疫特性上。此外,疫苗的免疫劑量,免疫方式和免疫程序都是值得深入探討的問題。一個成功的HCV疫苗必須能夠激發(fā)出較強的體液免疫反應和細胞免疫反應,體液免疫反應主要指誘導機體產(chǎn)生針對HCV包膜糖蛋白1和2(gpE1和gpE2)的病毒中和抗體,細胞免疫反應包括特異性的受MHC-Ⅱ類分子限制的CD4+輔助性T細胞以及受MHC-Ⅰ類分子限制的CD8+殺傷性T細胞的生成,上述兩個類型的T細胞均能夠分泌諸如干擾素γ(IFN-γ)之類的抗病毒細胞因子,其中CD8+殺傷性T細胞還具有清除被感染細胞的作用。 目前HCV疫苗研究領域中已經(jīng)誕生了不少候選疫苗,這些研究一般都使用重組HCV包膜糖蛋白gpE1和gpE2作為疫苗中的抗原,但是無論如何在疫苗的前期研究工作中都需要候選分子的高效表達,以便在體外評價其免疫效果,針對HCV的高度變異性以及其他研究中表達的亞單位多肽誘發(fā)的體液免疫反應較弱等問題,我們選取了HCV基因組中相對保守并且也是T細胞表位非常集中的NS3區(qū)的一段780bp的DNA序列,另外為了提高對B細胞的激活能力,誘生出中和抗體,我們查閱文獻后選取了三個保守的廣譜中和抗原位點,將這些抗原表位融合表達,可望生成的融合蛋白具備較強的免疫原性并且能夠?qū)Σ煌?不同株的HCV提供保護作用,從而克服阻止HCV的感染,為丙型肝炎疫苗的研制作一些鋪墊。本實驗中通過微量中和試驗以及CTL殺傷實驗評價了HCV多表位融合蛋白的體液免疫原性和細胞免疫原性,為HCV疫苗的研制提供了一定的實驗基礎。另外,該融合蛋白也可作為臨床診斷的候選抗原,在提升HCV診斷試劑的靈敏度和特異性方面具有一定的參考價值。 一、丙型肝炎病毒多表位融合蛋白在原核系統(tǒng)中的表達 根據(jù)文獻報道：我們挑選出位于HCV包膜蛋白區(qū)的三個B細胞表位(aa192～aa202:YEVRNVSGVYH:aa313～aa327:ITGHRMAWDMMMNWS: aa702～aa710:PALSTGLIH)與NS3區(qū)一段T細胞表位非常集中的區(qū)域融合,利用原核表達系統(tǒng),以pET-11d作為載體,在大腸埃希菌BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導表達獲得融合蛋白,之后采用DEAE陰離子交換和鎳離子柱親和層析進行純化后獲得了HCV多表位融合蛋白。通過Western Blot驗證融合蛋白的抗原活性。 二、丙型肝炎病毒感染模型的建立 長期以來,由于缺乏有效的HCV體外細胞培養(yǎng)體系,嚴重影響了對HCV生命周期的探討及抗HCV藥物的研發(fā)。本研究中,我們通過體外轉(zhuǎn)錄帶有JFH1基因組全長的質(zhì)粒從而獲得了具有感染性的HCV JFH1毒株基因組全長RNA,之后進一步轉(zhuǎn)染Huh7.5細胞建立了HCV的細胞培養(yǎng)體系,該體系能夠產(chǎn)生有體外感染活性的HCVcc顆粒,我們使用反轉(zhuǎn)錄PCR以及間接免疫熒光兩種技術(shù)檢測到了轉(zhuǎn)染后的細胞培養(yǎng)上清中HCVcc顆粒的存在,并且通過對Huh7.5細胞的再次感染證明了獲得的HCVcc顆粒的感染性。 三、評價丙型肝炎病毒多表位融合蛋白的細胞免疫原性和體液免疫原性 我們通過流式細胞儀分析了免疫后的小鼠脾臟細胞以及外周血淋巴細胞經(jīng)該多表位蛋白刺激后的增殖情況,顯示出了比較好的細胞免疫效果,在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了能夠識別HCV相應抗原位點的典型特異CTL效應,說明免疫應答過程中的T淋巴細胞系統(tǒng)經(jīng)過此抗原的刺激而得到了有效的激活,并在再次遇到相同的抗原肽時發(fā)揮其細胞毒性殺傷細胞效應。 另外,該蛋白在家兔體內(nèi)所誘導的抗體水平迅速升高并且能夠維持相當長的時間,當注射到家兔體內(nèi)的抗原劑量為200ug/只時,HCV中和抗體的檢測結(jié)果也為陽性,提示HCV多表位融合蛋白可能具有中和HCV野生毒株的能力,可以應用到HCV預防性疫苗的開發(fā)上。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

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