本文選題：白質消失病　切入點：真核細胞翻譯起始因子2B　出處：《復旦大學》2010年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：elF2B(eukaryotic initiation factor 2B中文名：真核細胞翻譯起始因子2B)在mRNA的翻譯和調控中發(fā)揮了關鍵的作用。eIF2B由5個亞基(α-ε)構成,eIF2Bε是五個亞基中最大的一個,它包含了負責催化eIF2 GDP/GTP互換反應的催化結構域。eIF2Bε與eIF2Bγ顯示出巨大的序列相似性,二者形成了一個催化亞復合體,這個催化亞復合體與eIF2Bα,β和6亞基形成的調節(jié)亞復合體形成全復合體。eIF2B基因突變會導致一種名為VWM(vanishing white matter disease中文名：腦白質消失病)的神經(jīng)系統(tǒng)病變,這種疾病的臨床表型非常多樣。為了有助于我們理解VWM的病因,我們研究了eIF2B復合體的整合和VWM突變對eIF2B功能的影響。我們的數(shù)據(jù)顯示,eIF2Bε和eIF2BγN (?)(?)區(qū)域特定的保守殘基對于這2個亞基之間以及它們與調節(jié)亞復合體之間的相互作用是非常重要的。這個區(qū)域與核苷酰轉移酶蛋白家族顯示出同源性,但是在此類蛋白質中的保守氨基酸殘基并不是GDP/GTP互換反應所必需的。eIF2Bε和γ中的第二個保守區(qū)域同樣與亞基間的相互作用相關,這個區(qū)域包含一系列重復出現(xiàn)的支鏈氨基酸如亮氨酸、異亮氨酸、頡氨酸,eIF2Bε的He 385發(fā)揮了重要的作用。我們還研究了elF2Bβγδε內部的一系列VWM突變,這些突變對eIF2B復合體的形成和GEF活性都顯示出不同程度的影響,這種多樣性可以幫助我們理解VWM臨床表型的多樣性。具體來說就是：(Ⅰ)一些突變,特別是在催化結構域的突變會導致活性的降低；(Ⅱ)在催化結構域的VWM突變會導致eIF2B無法與其底物結合；(Ⅲ)與之相對的是某些VWM突變如V73G反而顯示出增強的活性；(Ⅳ)某些eIF2Bβ,γ或δ的VWM突變對復合體形成和GEF活性只有很小的影響或是沒有影響；(Ⅴ)eIF2Bδ突變A391D和R483W都會導致先天性疾病,但是他們對于elF2B復合體的形成及活性卻有著完全相反的作用(R483W會嚴重地影響復合體形成和GEF活性,而A391D對兩者都沒有影響)。因此,在疾病的嚴重性和突變導致的eIF2B體外生化性質改變之間沒有明顯的相關性,某些突變可能會影響eIF2B的其他功能(目前末知)。這些數(shù)據(jù)擴展了我們對于eIF2B復合體的結構組織的認識,并且有助于我們進一步了解這個關鍵蛋白因子以及它在VWM中的作用。 mTOR(mammalian target of rapamycin)在細胞內以兩種不同的復合體形式存在,即mTORC1和mTORC2。有關mTORC2的功能研究得還不是很充分,已知的包括調控細胞骨架重排,細胞存活等。mTORC1作為細胞內的中樞調節(jié)因子參與了多種細胞進程的調控,如蛋白質合成、基因轉錄、細胞周期進程、自噬、核糖體的生物合成等。核糖體的合成是細胞分裂過程中非常重要的,進化上高度保守的,需要高度協(xié)調的復雜進程,對于細胞保持合適的增殖速度和穩(wěn)定的細胞大小是必須的。核糖體的合成需要三個RNA多聚酶協(xié)同作用才能夠精密地完成,PolⅠ負責轉錄核糖體47S pre-rRNA; PolⅡ負責轉錄核糖體蛋白質的(?)nRNA; PolⅢ負責轉錄5s rRNA。mTORC1調控核糖體的生物合成已經(jīng)成為一個不爭的事實,對于其調控機制在酵母中研究也取得了令人矚目的成就。在酵母中的研究顯示,TORC1能夠在細胞核和細胞質之間穿梭,并且能夠直接和PolⅠ啟動子結合,磷酸化相關的轉錄因子,直接激活PolⅠ的轉錄。類似的,TORC1也能夠與TFIIIC結合磷酸化mafl,解除其對PolⅢ的抑制,而酵母的核糖體蛋白質的表達也在轉錄水平被mTORC1調節(jié)。人們試圖在哺乳動物細胞中重復類似的研究,已經(jīng)取得了一些成就,但也發(fā)現(xiàn)了一些與酵母中完全不同的調控方式：哺乳動物mTORC1也在核質間穿梭,并且能夠直接與TFIIIC結合磷酸化MAF1進而激活polⅢ的轉錄,mTORC1也能夠激活polⅠ的轉錄,但是至今沒有證據(jù)顯示mTORC1能夠直接與polⅠ啟動子結合,磷酸化并激活相關的轉錄因子。而mTORC1對哺乳動物核糖體蛋白質的調控已經(jīng)被證明是在翻譯水平而不是轉錄水平,而mTORC1對于rRNA加工的調控還不是很清楚。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)mTORC1能夠直接和rRNA加工過程中的重要蛋白質BOP1在體內和體外直接的相互作用,而缺乏N端264個氨基酸的一個負顯性突變雖然在體外可以與mTORC1相互作用,但是在體內卻不能,暗示細胞定位對于其相互作用是必須的。此外,我們發(fā)現(xiàn)BOP1所在的PeBoW復合體缺陷(siRNA沉默實驗和表達負顯性突變實驗)能夠作用于mTORC1信號通路,提高(?)nTORC1下游底物S6K1的磷酸化水平和激酶活性,而不會影響(?)nTORC1另一底物4EBP1的磷酸化水平,這種只針對S6K1的特異性調控與Actinomycin D以及rapamycin的效果類似。這暗示mTORC1對于其下游不同的底物可以以不同的方式進行調控。此外,我們發(fā)現(xiàn)BOP1內部有個mTORC1底物特異性基序--TOS基序,突變這個基序會減弱BOP1△的負顯性表型(對S6K1的反饋激活,對rRNA加工的阻斷和對細胞周期的抑制)。并且我們發(fā)現(xiàn),這種調控不像DNA損傷壓力那樣是通過激活p38MAPK通路激活mTORC1。我們還發(fā)現(xiàn)BOP1是一個磷酸化蛋白質,暗示BOP1在翻譯后水平受到某些激酶的調節(jié),以迅速響應細胞內外的信號轉導事件。BOP1S126S127是其磷酸化位點之一,PKA和CKII能夠在體外磷酸化BOP1。我們的結果顯示mTORC1在rRNA的加工過程中發(fā)揮了重要的作用,另外PeBoW復合體特異性的rRNA加工阻斷會作用于mTORC1并特異性地激活S6K1,對十這種現(xiàn)象的生物學意義還不是很清楚。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R346

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本文編號：1573590