本文選題：THAP11　切入點(diǎn)：轉(zhuǎn)錄　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： THAP11屬于新發(fā)現(xiàn)的THAP蛋白質(zhì)家族成員。該蛋白家族是一類鋅離子依賴的DNA結(jié)合蛋白質(zhì),廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡調(diào)控,并可能與染色體修飾與重構(gòu)相關(guān)。前期研究表明THAP11可通過直接結(jié)合c-Myc啟動子區(qū)抑制c-Myc表達(dá),進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。此外,THAP11還可調(diào)控胚胎干細(xì)胞(ES)的自我更新和增殖。但目前對其作用機(jī)制尚無深入研究。本研究利用哺乳動物雙雜交系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)THAP11同時具有轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制活性,并通過系列缺失,確定了其功能結(jié)構(gòu)域, N端82個氨基酸區(qū)具有轉(zhuǎn)錄抑制活性,C端185個氨基酸區(qū)具有轉(zhuǎn)錄激活活性。THAP11發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制活性與染色體修飾相關(guān)因子關(guān)系。進(jìn)一步利用酵母雙雜交技術(shù),從成人肝臟cDNA文庫中篩選到CtBP1可與THAP11發(fā)生相互作用。利用免疫共沉淀技術(shù),我們證實(shí)了THAP11與CtBP1存在相互作用,并確定了兩種相互作用結(jié)構(gòu)域。鑒于該蛋白可通過直接的蛋白質(zhì)相互作用參與轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制的過程,THAP11與CtBP1相互作用可能是THAP11發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制活性的方式。為進(jìn)一步探討THAP11調(diào)控基因表達(dá)的分子機(jī)制,對全基因組進(jìn)行THAP11潛在結(jié)合位點(diǎn)的檢索,發(fā)現(xiàn)Oct4啟動子含有THAP11潛在的結(jié)合位點(diǎn)。分離人Oct4啟動子區(qū),構(gòu)建報告基因載體,發(fā)現(xiàn)THAP11可激活Oct4啟動子轉(zhuǎn)錄,這種激活活性依賴于其C端轉(zhuǎn)錄激活區(qū),而與其DNA結(jié)合能力無關(guān)。EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)THAP11能夠結(jié)合預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,但系列缺失突變實(shí)驗(yàn)證實(shí)THAP11對Oct4啟動子的激活并不依賴該結(jié)合位點(diǎn),表明THAP11可能通過其它機(jī)制調(diào)控Oct4的表達(dá)。利用Real-time PCR實(shí)驗(yàn)表明,在PA-1細(xì)胞中過表達(dá)THAP11可明顯上調(diào)內(nèi)源Oct4的表達(dá),表明Oct4是THAP11調(diào)控的靶基因。為進(jìn)一步在ES細(xì)胞中檢測THAP11功能及作用機(jī)制,構(gòu)建了人THAP11的慢病毒表達(dá)載體,并對慢病毒進(jìn)行了包裝,獲得了THAP11慢病毒顆粒,為后續(xù)的研究提供了有力的工具。
[Abstract]:THAP11 is a newly discovered member of THAP protein family, which is a zinc ion-dependent DNA binding protein, which is widely involved in cell proliferation and apoptosis regulation. Previous studies have shown that THAP11 can inhibit c-Myc expression by direct binding to c-Myc promoter region. In addition, THAP11 can also regulate the self-renewal and proliferation of embryonic stem cell (es). However, there is no in-depth study on the mechanism of its action. In this study, the mammalian two-hybrid system was used. We found that THAP11 has both transcriptional activation and transcriptional inhibitory activity, and through a series of deletions, Its functional domain was determined. The N-terminal 82 amino acid regions had transcriptional inhibitory activity and C-terminal 185 amino acid regions had transcriptional activation activity. THAP11 played a role in the relationship between transcription inhibitory activity and chromosome modification. Further more, yeast two-hybrid technique was used. CtBP1 could interact with THAP11 from adult liver cDNA library. We confirmed that there was interaction between THAP11 and CtBP1 by immunoprecipitation. Two kinds of interaction domains were identified. In view of the direct protein interaction this protein can participate in the process of transcription inhibition by transcription factors. The interaction between THAP11 and CtBP1 may be the way in which THAP11 exerts its transcription inhibitory activity. In order to further explore the molecular mechanism of gene expression regulated by THAP11, By searching the whole genome for the potential binding sites of THAP11, we found that the Oct4 promoter contains the potential binding site of THAP11. The reporter gene vector was constructed by isolating the promoter region of human Oct4. It was found that THAP11 could activate the transcription of Oct4 promoter. This activation activity is dependent on its C-terminal transcriptional activation region, but independent of its DNA binding ability. EMSA experiments confirm that THAP11 can bind to predicted binding sites. However, a series of deletion mutation experiments confirmed that the activation of Oct4 promoter by THAP11 does not depend on the binding site, suggesting that THAP11 may regulate the expression of Oct4 through other mechanisms. Overexpression of THAP11 in PA-1 cells significantly upregulated the expression of endogenous Oct4, suggesting that Oct4 was a target gene regulated by THAP11. In order to further detect the function and mechanism of THAP11 in es cells, the lentivirus expression vector of human THAP11 was constructed. The lentivirus was packaged and THAP11 lentivirus particles were obtained, which provided a powerful tool for further research.
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R346

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本文編號：1573218