本文選題：NKT細胞　切入點：IFN-γ　出處：《山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的自然殺傷T細胞(natural killer T cells,NKT)是免疫細胞中一類具有特定標(biāo)志的T淋巴細胞亞群,也是機體重要的免疫調(diào)節(jié)細胞。細胞表面可以共表達NK細胞和T細胞的表面標(biāo)記分子:α/βTCR與NK1.1、CD16、LY49A、LY49C等。NKT細胞表面半恒定TCR的表達具有高度的限制性。與B細胞和傳統(tǒng)T細胞不同,NKT細胞不能識別由主要組織相容性復(fù)合物(MHC)遞呈的多肽,只能特異性識別由抗原遞呈細胞表面CD1d分子所遞呈的糖脂類分子,NKT細胞活化后能夠迅速分泌大量的Th1(IFN-γ)型和Th2(IL-4)型細胞因子,這些細胞因子是NKT細胞執(zhí)行免疫調(diào)節(jié)功能的關(guān)鍵分子,在固有免疫和獲得性免疫間發(fā)揮著橋梁作用。近年來關(guān)于NKT細胞功能和調(diào)節(jié)的研究引起了人們極大的興趣,成為免疫學(xué)研究的一個新熱點。 研究發(fā)現(xiàn),一種來源于海洋生物海綿提取物的糖脂類物質(zhì)——α-半乳糖神經(jīng)酰胺(α-Galactosylceramide,α-GalCer)具有直接激活NKT細胞的能力,是公認(rèn)的NKT細胞外源性配體。大量動物實驗證實了α-GalCer在抗腫瘤及調(diào)節(jié)自身免疫性疾病過程中的積極作用。但是,隨著研究的深入,人們越來越深刻地意識到α-GalCer這種強大的NKT細胞激活劑所帶來的副作用,主要包括:誘導(dǎo)NKT細胞無能、造成急性肝臟損傷、導(dǎo)致動物流產(chǎn)、加重粥樣硬化等等。最近,Zhou等報道了一個內(nèi)源性NKT細胞配體iGb3,也具有活化小鼠和人NKT細胞的作用,但其激活作用遠差于外源性配體α-GalCer。因此有目的的對糖脂進行改造或?qū)ふ移渌鸑KT細胞激活劑已成為應(yīng)用糖脂類藥物進行臨床治療所亟需。 基于此目的,我們將糖脂α-GalCer和iGb3分子進行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾和改造,通過比較α-GalCer與經(jīng)過化學(xué)修飾的糖脂類似物結(jié)構(gòu)上的差異,觀察它們激活NKT細胞能力的不同,希望從中篩選出優(yōu)勢誘導(dǎo)Th1或者Th2細胞因子分泌的類似物,深入探討Th1/Th2反應(yīng)偏移的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),為今后合理設(shè)計糖脂藥物并應(yīng)用于臨床抗腫瘤和抗感染治療打下基礎(chǔ)。 方法(1) ELISA法篩選具有Th1/Th2型細胞因子分泌優(yōu)勢的α-GalCer和iGb3類似物。將6-8周齡成年C57BL/6雄鼠分組,每組設(shè)三只小鼠,通過腹腔給藥的方法,分別注射5種α-GalCer類似物和7種iGb3類似物,在給藥后不同時間點收集小鼠血清,通過血清的ELISA檢測,動態(tài)觀察藥物對小鼠血清中Th1型細胞因子IFN-γ和Th2型細胞因子IL-4分泌的影響,篩選具有優(yōu)勢誘導(dǎo)Th1型或者Th2型細胞因子分泌能力的α-GalCer和iGb3類似物。(2)證實所篩選出的iGb3類似物能夠活化小鼠NKT細胞,發(fā)揮優(yōu)勢誘導(dǎo)作用。將ELISA法篩選出的兩種具有Th1型細胞因子分泌優(yōu)勢的iGb3類似物注射到小鼠體內(nèi),在給藥后不同時間點處死小鼠,同時分離小鼠肝臟和脾臟淋巴細胞,通過流式細胞儀檢測用藥后小鼠肝臟和脾臟中NKT細胞的數(shù)量變化情況,分析肝臟NKT細胞早期活化標(biāo)志CD69分子的表達情況。(3)證明所篩選出的兩種iGb3類似物能夠優(yōu)勢誘導(dǎo)活化肝臟和脾臟NKT細胞分泌IFN-γ。將篩選出的兩種具有Th1型細胞因子分泌優(yōu)勢的iGb3類似物注射到小鼠體內(nèi),在用藥后不同時間點處死小鼠,分離小鼠肝臟和脾臟淋巴細胞,通過流式細胞儀檢測小鼠肝臟和脾臟NKT細胞群中產(chǎn)生IFN-γ和IL-4的陽性細胞比例情況。(4)觀察所篩選出的具有優(yōu)勢誘導(dǎo)NKT細胞Th1型細胞因子分泌能力的iGb3類似物的抗腫瘤作用。分離培養(yǎng)C57BL/6小鼠骨髓來源的DC細胞,將其負載上糖脂4′′′-dh-iGb3,共孵育后通過尾靜脈注射到荷瘤小鼠的體內(nèi),分別在荷瘤后第一周和第四周觀察腫瘤的生長情況。 結(jié)果 一、4-HO-iGb3和4′′′-dh-iGb3具有優(yōu)勢誘導(dǎo)Th1型細胞因子分泌的能力。收集給藥后不同時間點(4h、6h、12h、24h、48h)C57BL/6小鼠尾靜脈血,離心吸取血清,雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測藥物作用后小鼠血清中IFN-γ和IL-4的分泌情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)過化學(xué)修飾的兩種iGb3類似物4-HO-iGb3和4′′′-dh-iGb3具有優(yōu)勢誘導(dǎo)Th1型細胞因子分泌的能力。而經(jīng)過化學(xué)修飾的幾種α-GalCer類似物誘導(dǎo)細胞因子分泌的能力較差。 二、4-HO-iGb3和4′′′-dh-iGb3這兩種iGb3類似物能夠活化小鼠NKT細胞,并通過小鼠肝臟和脾臟淋巴細胞分泌IFN-γ。 分離小鼠肝臟和脾臟組織,提取肝臟和脾臟淋巴細胞,流式細胞術(shù)分析注射PBS、iGb3、4-HO-iGb3、4′′′-dh-iGb3后不同時間點各組別小鼠肝臟和脾臟中NK1.1+CD3+(雙陽)的NKT細胞數(shù)量變化情況,同時檢測肝臟這群雙陽性細胞表面活化標(biāo)記CD69的表達情況。結(jié)果表明,給予糖脂4-HO-iGb3和4′′′-dh-iGb3對NKT細胞的數(shù)量影響不大,但兩用藥組NKT細胞表面分子CD69的表達高于溶媒對照組,證實4-HO-iGb3和4′′′-dh-iGb3這兩種iGb3類似物確實能夠活化NKT細胞。同時通過胞內(nèi)染色檢測NK1.1+CD3(+雙陽)的NKT細胞胞內(nèi)的IFN-γ和IL-4的表達情況,發(fā)現(xiàn)4-HO-iGb3和4′′′-dh-iGb3組NKT細胞內(nèi)IFN-γ陽性的細胞比例要高于未經(jīng)過修飾的iGb3組,且IFN-γ+/IL-4+的細胞比例大于1,說明4-HO-iGb3和4′′′-dh-iGb3能夠活化小鼠NKT細胞分泌IFN-γ,而以4′′′-dh-iGb3的作用更為明顯。 三、DC負載的糖脂分子4′′′-dh-iGb3能夠明顯抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長。我們無菌分離C57BL/6小鼠的股骨和脛骨,加入細胞因子GM-CSF和IL-4體外誘導(dǎo)骨髓來源的DC細胞分化成熟,然后將成熟的DC細胞負載上藥物,通過小鼠尾靜脈注射到荷瘤小鼠體內(nèi),觀察DC細胞負載的藥物對荷瘤小鼠腫瘤的生長情況的影響,發(fā)現(xiàn)DC細胞負載的4′′′-dh-iGb3組與DC+ iGb3組、DC+溶媒組相比較能夠有效的抑制小鼠黑色素瘤的生長,起到抑瘤作用。 結(jié)論(1)化學(xué)修飾的iGb3類似物4-HO-iGb3和4′′′-dh-iGb3能夠激活小鼠NKT細胞,并優(yōu)勢誘導(dǎo)NKT細胞分泌IFN-γ,而以4′′′-dh-iGb3的作用更為明顯。(2) DC負載的4′′′-dh-iGb3能夠明顯抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長。(3) 4′′′-dh-iGb3可以作為一種新型的非特異性免疫佐劑用于抗腫瘤治療。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392.5

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