本文選題：人胚胎干細胞　切入點：HESRG基因　出處：《中南大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 胚胎干細胞(embryonic stem cell,ES細胞)來源于胚胎發(fā)育囊胚階段的內(nèi)細胞團,可以分化成機體三個胚層來源的所有組織細胞。自從1981年由Evans和Kaufman等建立了首個鼠ES細胞系及1998年Thomson等分離得到人ES細胞以來,ES細胞研究得到了長足發(fā)展,目前仍是生命科學(xué)研究熱點之一。ES細胞的多向分化潛能使其在臨床再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有巨大應(yīng)用前景,然而發(fā)揮ES細胞在臨床治療方面巨大作用的前提是如何在體外擴增ES細胞,并保持其全能性。人ES細胞在體外培養(yǎng)時容易自發(fā)分化,因此需要將其培養(yǎng)在胚胎成纖維細胞上或利用添加細胞因子的條件培養(yǎng)基維持不分化,然而這些方法都較繁瑣,不適合大規(guī)模培養(yǎng),并且可能造成外源性蛋白污染。要找到一種更適合更簡便的人ES細胞培養(yǎng)條件,首先必須要了解維持人ES細胞自我更新和多潛能性的分子機制。先前文獻研究報道顯示:多種因素參與調(diào)控人ES細胞自我更新,其中包括轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、Nanog、Sox2等),信號通路(TGFβ信號通路、WNT信號通路、FGF和PI3K信號通路等),細胞周期調(diào)控因子,microRNA,染色體穩(wěn)定性及DNA甲基化等。Oct4、Nanog、Sox2是目前研究較多的參與調(diào)控人ES細胞自我更新的轉(zhuǎn)錄因子,它們在人ES細胞中高表達,通過抑制人ES細胞向某一胚層分化來維持人ES細胞多潛能性,并且它們之間可相互作用形成復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控環(huán)路,共同維持人ES細胞的多潛能性。近來研究報道除上述幾個關(guān)鍵基因外,人ES細胞中還存在其它已知或未知基因參與其自我更新的調(diào)控過程,然而日前它們在人ES細胞中的功能及調(diào)控機制遠未闡明。為了探索和揭示除Oct4、Nanog、Sox2外其它維持人ES細胞多潛能性的基因及其功能,更深入地闡明人ES細胞自我更新的復(fù)雜機制,本課題開展了人ES細胞自我更新相關(guān)基因的高通量篩選,并且進行了人ES細胞自我更新相關(guān)新基因的克隆和功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究。 【人胚胎干細胞和擬胚體基因表達譜的初步分析】 基因芯片為高通量基因表達研究提供了一個有利工具。本研究中采用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array芯片分析比較了未分化人ES細胞(H9)和分化7天的擬胚體(7-day embryoid bodies,7-day EBs)基因表達譜,檢測到在人ES細胞分化形成的7-day EBs中約1100個基因表達下調(diào)大于2倍及2200個基因表達上調(diào)2倍以上,并通過real-time PCR證實了芯片結(jié)果的可靠性。在表達下調(diào)2倍及以上的基因中,包含了許多已經(jīng)證實在維持人ES細胞自我更新中發(fā)揮重要作用的基因。例如:Oct4表達下調(diào)約14倍,Nanog表達下調(diào)約17倍,Sox2表達下調(diào)約2.6倍。目前已初步揭示在維持人ES細胞多潛能性過程中發(fā)揮一定作用的基因也被檢測出在7-day EBs中表達顯著下調(diào)。例如:TDGF1表達下調(diào)約11倍;LEFTB表達下調(diào)約42倍,DNMT3B下調(diào)約8倍等。此外,基因芯片檢測結(jié)果中包含了大量未知基因(假定蛋白和EST序列),這些未知基因在人ES細胞分化時表達顯著改變,但它們的完整基因序列目前仍未獲得。其中兩個EST序列(GenBank登錄號:BF223023、BC020935)在人ES細胞中表達水平較高,尤其是BF223023在未分化人ES細胞中表達水平與Oct4和Nanog相似,而當(dāng)人ES細胞分化形成EBs時其表達顯著下調(diào)(19.7倍),并且在多篇文獻報道的芯片結(jié)果中均有出現(xiàn),提示我們該EST所代表的基因可能與人ES細胞自我更新調(diào)控相關(guān)。 為了在高通量水平分析人ES細胞分化的早期分子事件,我們又對芯片結(jié)果中表達下調(diào)和上調(diào)2倍及以上的基因進行了基因歸類注解分析(Gene Ontology,GO)。通過GO網(wǎng)站在線分析,我們得到每個基因最具代表性的GO術(shù)語。根據(jù)基因功能分類注釋研究我們也發(fā)現(xiàn)表達改變2倍及以上的基因包含大量與細胞分化和胚胎發(fā)育相關(guān)的基因。由此可見,GO分類注釋為我們研究與人ES細胞分化和自我更新機制以及胚胎發(fā)育過程的分子事件提供了重要線索。 【人胚胎干細胞特異性高表達新基因的克隆和鑒定】 將BF223023作為種子序列,在人EST數(shù)據(jù)庫中尋找與其匹配的序列,之后利用手工方法將所檢索到的EST重疊群拼接獲得一個長度約2330bp的序列。檢索NCBI網(wǎng)站的人類非冗余基因數(shù)據(jù)庫未發(fā)現(xiàn)其它基因與該序列匹配,說明該基因是一個新基因,我們將其命名為人胚胎干細胞相關(guān)基因(Human embryonic stem cell related gene,HESRG)(GenBank登錄號:DQ445779)。HESRG新基因序列3'端包含一個polyA尾及AATAAA加尾信號,說明該序列包含完整3'非翻譯區(qū)。但是從基因序列分析尚不能確定其5'末端完整性,因此我們利用Smart RACE PCR試劑盒擴增該基因完整的5'末端。最終我們得到:HESRG基因cDNA序列的全長為3141bp,定位于人類染色體3p14.3。將該基因與NCBI中非冗余核酸數(shù)據(jù)庫進行比對,結(jié)果顯示HESRG基因僅與人類及類人猿的基因組序列匹配,在其它物種中均未發(fā)現(xiàn)有相似序列,提示HESRG基因可能是一種靈長類動物ES細胞特異性表達的新基因。 通過Northern blot確定在人ES細胞中HESRG的兩個轉(zhuǎn)錄本,分別是3.1Kb和1.2Kb。利用NCBI網(wǎng)站的ORF Finder在線程序預(yù)測HESRG基因編碼框架(open reading frame,ORF)。結(jié)果顯示HESRG的mRNA序列包含兩個候選ORFs,它們均可能編碼蛋白質(zhì)。候選ORF-1的起始密碼子CTG位于2-4bp處,終止密碼子位于668-670bp處;候選ORF-2的起始密碼子ATG位于2245-2247bp處,終止密碼子位于2485-2487bp處。ORF-1編碼包含222個氨基酸的蛋白質(zhì)HESRP-1,預(yù)測分子量為24KD,理論等電點為9.37,包含亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)及蛋白激酶C磷酸化位點,在線軟件LOCtree預(yù)測該蛋白表達定位于細胞核內(nèi)。HESRP-1與多個假定蛋白有較高同源性,并與核糖核苷酸二磷酸還原酶(RNR)及E2F家族成員E2F-7有部分同源性。根據(jù)生物信息學(xué)分析我們推測HESRP-1可能作為轉(zhuǎn)錄因子,參與組織發(fā)育和細胞分化過程。ORF-2編碼蛋白質(zhì)HESRP-2的預(yù)測分子量為8.7KD,理論等電點為5.75,無典型蛋白結(jié)構(gòu)域,含有4個蛋白激酶C磷酸化位點、2個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、1個肉豆蔻酰基位點,可能存在一個疏水區(qū)和2個hotloops結(jié)構(gòu),與兩個假定蛋白序列具有較高同源性。由于HESRP-2缺少保守結(jié)構(gòu)域、缺乏已知同源蛋白,因此較難預(yù)測其功能。 啟動子是控制轉(zhuǎn)錄起始,并決定基因表達強度的序列,它在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中扮演非常重要角色。我們提取HESRG基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游2000bp序列,采用Neural Network Promoter Prediction程序在線預(yù)測顯示,位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游2000bp序列中包含了多個候選啟動子區(qū),提示該區(qū)域可能具有啟動子活性。轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點是轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因表達時,與基因調(diào)控區(qū)結(jié)合的特異性DNA序列。我們采用Transcription ElementSearch Software(TESS)程序在線預(yù)測HESRG基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游2000bp的序列中包含的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,發(fā)現(xiàn)該區(qū)域包含許多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,如Oct4、Oct1、SRY、LEF1和TCF1等。Oct4是維持人ES細胞自我更新的一個關(guān)鍵基因,在人ES細胞中高表達,由此我們推測HESRG基因可能是Oct4在人ES細胞中調(diào)控的靶基因之一。以上生物信息學(xué)分析為我們開展HESRG基因功能和轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究提供了線索。 HESRG基因在人ES細胞中高水平表達,而在正常胎兒組織、成人正常睪丸組織、多種腫瘤和正常細胞系中均不表達,說明HESRG基因表達具有特異性,可能僅在多潛能性干細胞中表達。為了證明HESRG基因是人ES細胞多潛能性標(biāo)志基因之一,我們采用多種方法誘導(dǎo)人ES細胞分化。利用RT-PCR方法檢測HESRG、Oct4及Nanog在這些組織和細胞中的表達水平。結(jié)果顯示在分化7天、14天、21天的EBs中HESRG表達水平較人ES細胞中顯著降低,且隨分化時間逐步降低;在維甲酸(Retinoic acid,RA)誘導(dǎo)的分化細胞和人ES細胞接種到SCID鼠體內(nèi)形成的畸胎瘤中未檢測到HESRG表達。HESRG表達變化趨勢與Oct4和Nanog相似。Oct4和Nanog已被證明是ES細胞多潛能性的標(biāo)志基因,在維持ES細胞自我更新中發(fā)揮重要作用,因此根據(jù)以上結(jié)果我們初步揭示HESRG是一個新的人ES細胞多潛能性標(biāo)志基因,可能參與維持人ES細胞的多潛能性。 【HESRG基因的功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究】 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是近年來興起的一項研究基因功能的新技術(shù),以其簡便、高效和特異等優(yōu)點,漸已成為基因功能缺失研究的首選策略。為了在人ES細胞中建立高效RNAi方法,我們平行比較了三種轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAiMAX(RNAiMAX)、Lipofectamine2000和Oligofectamine轉(zhuǎn)導(dǎo)siRNA進入人ES細胞所得到的RNAi效率。結(jié)果顯示,同樣條件下RNAiMAX介導(dǎo)的RNAi效率(＞80%)顯著高于其它兩種轉(zhuǎn)染試劑,說明RNAiMAX是一種高效的siRNA轉(zhuǎn)染試劑,同時也表明我們在人ES細胞中建立了一個高效、簡便的RNA干擾方法,為我們進一步研究人ES細胞中HESRG基因的功能提供了幫助。 結(jié)合基因芯片結(jié)果、HESRG表達特征檢測及生物信息學(xué)分析,我們推測HESRG在維持人ES細胞自我更新中發(fā)揮重要作用。進一步我們利用RNAi方法探索HESRG基因在人ES細胞中的功能,研究結(jié)果顯示:當(dāng)HESRG基因表達顯著下調(diào)(約75%)時人ES細胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)改變,由原先的緊密克隆性生長、增殖速度較快轉(zhuǎn)變成分散、細長、出現(xiàn)絲狀物、細胞增殖緩慢狀態(tài),而非打靶序列(陰性對照)轉(zhuǎn)染后細胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變。Real-time PCR檢測結(jié)果顯示:與非打靶序列轉(zhuǎn)染后的細胞相比較,干擾HESRG的細胞中多潛能性標(biāo)志基因均出現(xiàn)顯著下調(diào);而外胚層分化標(biāo)志基因Sox1、FGF5和Nestin表達明顯升高,尤其Nestin表達升高最為顯著,其它胚層的標(biāo)志基因的改變不明顯。進一步利用間接免疫熒光法在蛋白質(zhì)水平上檢測了Oct4、Nestin、Hand1、GATA4和CGβ在干擾前后的表達,結(jié)果顯示:在非打靶序列轉(zhuǎn)染后的人ES細胞中Oct4高表達,而Nestin、Hand1、GATA4和CGβ表達極其微弱或不表達;在HESRG干擾的細胞中出現(xiàn)較強的Nestin熒光信號,而Oct4的熒光信號則顯著下調(diào),其它蛋白的熒光信號改變均不明顯。由此證明HESRG基因可以抑制人ES細胞向外胚層分化,從而參與維持人ES細胞的多潛能性。 轉(zhuǎn)錄調(diào)控是真核生物基因表達調(diào)控的主要方式,順式調(diào)控元件在很大程度上決定了基因轉(zhuǎn)錄的精確起始及效率。定位和克隆目的基因啟動子是研究基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵。根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測的結(jié)果,我們采用PCR方法擴增了HESRG基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游-2049/+11區(qū)域的DNA序列,并利用熒光素酶報告基因系統(tǒng)證明該段序列具有啟動子活性。 生物信息學(xué)預(yù)測顯示,HESRG基因啟動子區(qū)域包含與Oct4轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。為了揭示Oct4對HESRG的調(diào)控作用,我們構(gòu)建了包含Oct4結(jié)合位點突變體的報告基因載體,檢測發(fā)現(xiàn)當(dāng)Oct4結(jié)合位點中兩個堿基發(fā)生突變后,在人ES細胞中HESRG基因啟動子活性顯著降低;進一步特異性地抑制人ES細胞中Oct4表達,HESRG基因啟動子活性同樣明顯降低;相反在HEK293細胞中外源性O(shè)ct4可顯著增強HESRG基因啟動子活性;另外染色質(zhì)免疫沉淀實驗也證實轉(zhuǎn)錄因子Oct4可以直接結(jié)合于HESRG基因啟動子區(qū)的Oct4結(jié)合位點上。上述實驗結(jié)果說明Oct4對HESRG基因具有直接的正調(diào)控作用。 總之,通過本課題研究,我們獲得了未分化人ES細胞和7-day EBs之間的基因表達譜及差異表達基因信息;根據(jù)一個差異表達顯著的EST序列克隆得到HESRG新基因,并對HESRG基因進行了較全面的生物信息學(xué)分析,詳細探討了HESRG基因表達分布及其與人ES細胞多潛能性的關(guān)系,初步揭示了HESRG基因在人ES細胞中的功能及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。這些研究結(jié)果將有助于全面了解維持人ES細胞自我更新的分子機制,明確HESRG基因在人ES細胞自我更新中的作用,并為其潛在的臨床應(yīng)用提供科學(xué)理論和實驗依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 郭遂群;邢福祺;龐占軍;方唯意;劉國炳;;子宮內(nèi)膜癌I型和II型全基因表達譜初步分析[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2006年06期

2 李峰,蔣衛(wèi)紅,楊旭宇,尹志華,馮湘玲,劉衛(wèi)東,王磊,周文,姚開泰;鼻咽癌相關(guān)基因NAP1的克隆及鑒定[J];生物化學(xué)與生物物理進展;2004年05期

3 趙明,任彩萍,蔣星軍,楊旭宇,張宏波,單文姣,周亮,馮湘玲;無飼養(yǎng)層培養(yǎng)人胚胎干細胞方法的建立[J];生命科學(xué)研究;2005年02期

4 ;Stem cell pluripotency and transcription factor Oct4[J];Cell Research;2002年Z2期

，

本文編號：1570004