本文選題：NRP1　切入點：單克隆抗體　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 背景:Neuropilin-1 (NRP1)是細胞表面相對分子量(Mr)為102,000Da的Ⅰ型跨膜糖蛋白,通過雜交瘤技術(shù)在歐洲蟾蜍的神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)首次被發(fā)現(xiàn)。進一步研究證明NRP1通常表達在內(nèi)皮細胞及一些腫瘤細胞,是Semaphorin3A(Sema3A)和血管內(nèi)皮生長因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)的受體,在神經(jīng)軸突的生長、血管的生成、發(fā)育和腫瘤轉(zhuǎn)移中起著重要的作用[1]。最近有研究表明NRP1在原始T細胞與dendritic cell (DCs)穩(wěn)定接觸中起重要作用,是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞持續(xù)的表面標志之一,不依賴于Treg細胞是否活化,在免疫反應(yīng)的起始上扮演著重要角色[2]。本課題組的前期研究已顯示血小板因子-4(Platelet Factor-4/PF4,又名CXCL4)可以刺激CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T(Treg)細胞的增殖[3],并與NRP1結(jié)合[4],同時在PF4刺激Treg細胞增殖過程中NRP1表達量增加[5],故推測NRP1在PF4刺激Tr增殖過程中發(fā)揮受體或共受體的作用。本研究為了進一步確定NRP1與PF4作用的結(jié)合位點或功能域,為Tr細胞的功能及其調(diào)控提供分子依據(jù),并具有應(yīng)用于治療自身免疫性疾病的前景。 方法及結(jié)果:NRP1在脊椎動物中高度保守,由胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)三部分組成,其中胞外段包括860個氨基酸,由3個不同的結(jié)構(gòu)域組成,分別稱為a1/a2、b1/b2和c。其中a1/a2又稱CUB結(jié)構(gòu)域(complement-binding protein homology),b1/b2結(jié)構(gòu)域與凝血因子Ⅴ和Ⅷ結(jié)構(gòu)相似同源,在c結(jié)構(gòu)域的中部含有MAM結(jié)構(gòu)域(meprin, A5,μ)。NRP1的胞外段各個區(qū)能和不同的分子結(jié)合介導(dǎo)不同的信號傳導(dǎo),Sema3A通過a1/a2/b1區(qū)與NRP1結(jié)合,VEGF165能與NRP1的b1/b2區(qū)結(jié)合,Heparin亦通過b1/b2區(qū)與NRP1結(jié)合,所以NRP1具有多種功能[6]。根據(jù)NRP1的結(jié)構(gòu)特點,本實驗采用原核表達的方式分段表達NRP1的a1/a2(CUB)、b1/b2(F5/8C)、MAM三個結(jié)構(gòu)域,分別得到融合蛋白后,免疫Balb/c鼠后,通過細胞融合制備單克隆抗體并對所制備抗體進行初步鑒定,鑒定后的抗體再與PF4做作用位點的篩選。 首先,搜索NRP1的蛋白序列(Human Protein Reference Database, www.hprd.org),分段截取NRP1的3個domain(CUB、F5/8C、MAM),從人單核細胞cDNA中擴增出3個片段基因。原核表達選擇pGEX-5X-1載體作為表達載體,根據(jù)載體的酶切圖譜設(shè)計引物,將NRP1的3個domain基因序列分別插入到pGEX-5X-1載體的EcoR I和Not I兩個限制性酶切位點之間,PCR反應(yīng)后,得到目的條帶;將擴增的目的片段從膠上回收后,進行T載體的連接;轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒后雙酶切,再與同時雙酶切的表達載體pGEX-5X-1載體進行連接,然后再轉(zhuǎn)化,各挑取兩個陽性克隆,搖菌后,進行測序鑒定。將測序鑒定正確的表達載體轉(zhuǎn)化入BL21菌株后誘導(dǎo)表達,獲得正確表達的目的蛋白并純化。 其次,將純化的GST-CUB、GST-F5/8C、GST-MAM融合蛋白與等體積福氏完全佐劑進行充分乳化,對Balb/c小鼠進行多點皮下注射。首次免疫后4周加強免疫一次,免疫原用量減為首免的一半,并與福氏不完全佐劑充分乳化。兩周后ELISA法檢測效價,效價在1:8000以上的小鼠即可進行加強免疫,加強免疫四天后進行細胞融合,ELISA法篩選能夠穩(wěn)定分泌抗CUB、F5/8C、MAM mAb的陽性克隆,并亞克隆,分別獲得能夠穩(wěn)定分泌CUB單克隆抗體的細胞系6株,分泌F5/8C單克隆抗體的細胞系5株,分泌MAM單克隆抗體的細胞系2株。 第三,用GST標簽蛋白通過Western blot對所獲單克隆抗體進行鑒定,其中不識別GST標簽蛋白而只識別融合蛋白的細胞株為識別目的蛋白的陽性株。結(jié)果顯示,識別CUB蛋白的陽性株:UAH058、UDC114、UDG054、UBB067、UCB064,識別F5/8C的陽性株:OCA084、OEG082,無識別MAM的陽性株。用ELISA法分別檢測PF4與CUB、F5/8C的相互作用[26],結(jié)果為:PF4與F5/8C存在特異的分子間相互作用。 結(jié)論:成功獲得的NRP1三個片段CUB、F5/8C、MAM的鼠抗人單克隆抗體的可應(yīng)用于蛋白結(jié)構(gòu)、定位、功能等常規(guī)的生命科學(xué)研究外,在臨床診斷和治療方面也具有重要的意義,初步證明了PF4可與NRP1的F5/8C區(qū)發(fā)生特異性的結(jié)合,將為今后NRP1分子的功能研究奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392;R73-3

【參考文獻】

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1 黃銀霞;韓俊;韓露;董辰方;高晨;王小凡;周偉;董小平;;α-Synuclein與14-3-3蛋白在體外分子間相互作用的鑒定[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;2007年06期

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本文編號：1570666