本文關(guān)鍵詞： 成骨細(xì)胞 力生長因子 增殖和分化 機(jī)械拉伸 SAGE　出處：《重慶大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 力生長因子(mechano-growth factor, MGF)是胰島素樣生長因子-1(insuin like growth factor-1, )基因的一種剪接變異體。該生長因子響應(yīng)力學(xué)刺激而表達(dá),現(xiàn)有研究表明其具有促進(jìn)肌肉肥大、心肌保護(hù)以及神經(jīng)修復(fù)等作用。在拉伸刺激成骨細(xì)胞時(shí)亦可發(fā)現(xiàn)MGF mRNA的高表達(dá),這提示MGF也是骨組織的力效應(yīng)分子,能對成骨細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響。但是MGF對骨組織的影響機(jī)制還不是很清楚,所以,本研究構(gòu)建了含有MGF基因的重組腺病毒載體,通過基因轉(zhuǎn)染、抗體受體阻斷研究MGF對成骨細(xì)胞增殖和分化行為的影響及可能的受體通道。另一方面,為了探究在基因水平上力刺激對成骨細(xì)胞的影響,本實(shí)驗(yàn)采用長標(biāo)簽基因表達(dá)系列分析法(long serial analysis of gene expression,LongSAGE)方法分析了拉伸刺激組與靜止對照組的基因表達(dá)差異及差異基因的表達(dá)豐度,以尋找特殊應(yīng)力環(huán)境下的差異表達(dá)基因。 主要內(nèi)容為: 1、構(gòu)建含有MGF基因的重組腺病毒載體。 2、大鼠原代成骨細(xì)胞的培養(yǎng)、純化、鑒定。 3、重組腺病毒載體感染3~6代成骨細(xì)胞,研究MGF對成骨細(xì)胞生理生化行為的影響。 4、介導(dǎo)MGF調(diào)控細(xì)胞生理功能的受體通道的研究。 5、對成骨細(xì)胞施以拉伸刺激,拉伸組施加應(yīng)變?yōu)?5%,頻率為0.5Hz的周期性拉伸24h,對照組靜止培養(yǎng)。收集細(xì)胞,提取RNA,用LongSAGE方法分析拉伸刺激對成骨細(xì)胞基因表達(dá)差異及豐度的影響。 主要結(jié)果為: 1、構(gòu)建了攜帶MGF基因的重組腺病毒載體,滴度可達(dá)8.5×108 pfu/mL。 2、培養(yǎng)了具有典型生物學(xué)行為的原代成骨細(xì)胞,經(jīng)過純化和鑒定,符合實(shí)驗(yàn)要求。取3~6代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 3、重組腺病毒載體感染成骨細(xì)胞并培養(yǎng)一段時(shí)間,MTT比色法分析結(jié)果表明MGF對成骨細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用。堿性磷酸酶檢測試劑盒(alkaline phosphatase,ALP)檢測ALP活性結(jié)果表明MGF能抑制ALP的分泌,提示MGF能抑制成骨細(xì)胞的分化。 4、受體是介導(dǎo)MGF調(diào)控細(xì)胞生理功能的受體通道之一,此外,細(xì)胞中還存在其他介導(dǎo)MGF調(diào)控的受體通道。 5、構(gòu)建LongSAGE標(biāo)簽庫分析周期性拉伸刺激對成骨細(xì)胞基因表達(dá)差異的影響,發(fā)現(xiàn)172個(gè)標(biāo)簽在拉伸組和對照組細(xì)胞中的表達(dá)具有顯著性差異。其中周期性拉伸刺激上調(diào)的標(biāo)簽有100個(gè),下調(diào)的標(biāo)簽72個(gè)。
[Abstract]:MGF is a splicing variant of insulin-like growth factor like like growth factor-1, which is expressed in response to mechanical stimulation and has been shown to promote muscle hypertrophy. The high expression of MGF mRNA was also found in osteoblasts stimulated by tension, suggesting that MGF is also a force effector molecule in bone tissue. However, the mechanism of the effect of MGF on bone tissue is not clear. Therefore, a recombinant adenovirus vector containing MGF gene was constructed and transfected by gene. To investigate the effects of MGF on the proliferation and differentiation of osteoblasts and the possible receptor channels in order to investigate the effects of stress stimulation on osteoblasts at the gene level, In this experiment, the long serial analysis of gene expression long SAGEA method was used to analyze the difference of gene expression and the expression abundance of the differentially expressed genes between the tensile and static control groups, in order to find the differentially expressed genes under the special stress environment. The main contents are:. 1. The recombinant adenovirus vector containing MGF gene was constructed. 2. Culture, purification and identification of rat primary osteoblasts. 3. The effect of MGF on physiological and biochemical behavior of osteoblasts was studied. 4. The study of receptor channel mediated by MGF to regulate cell physiological function. 5. The osteoblasts were stimulated by stretching. The cells in the stretching group were subjected to 15 strain and 0.5 Hz periodic stretching for 24 h. The cells were collected, RNAs were extracted, and the effects of stretch stimulation on the gene expression and abundance of osteoblasts were analyzed by LongSAGE method. The main results are:. 1.Recombinant adenovirus vector carrying MGF gene was constructed and its titer was 8.5 脳 108pfu-mL. 2. Primary osteoblasts with typical biological behavior were cultured and purified and identified to meet the requirements of the experiment. 3. The recombinant adenovirus vector was infected with osteoblasts and cultured for a period of time. The results of MTT colorimetric analysis showed that MGF could promote the proliferation of osteoblasts, and alkaline phosphatase assay kit (ALP) showed that MGF could inhibit the secretion of ALP. These results suggest that MGF can inhibit the differentiation of osteoblasts. 4. Receptor is one of the receptor channels mediating the regulation of cellular physiological function by MGF. In addition, there are other receptor channels that mediate the regulation of MGF in cells. 5. LongSAGE tag library was constructed to analyze the effect of cyclic stretch stimulation on gene expression of osteoblasts. It was found that there were significant differences in the expression of 172 tags between stretch group and control group, among which 100 tags were up-regulated by cyclic stretch stimulation. The downgraded labels were 72.
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329

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本文編號：1543742