本文關(guān)鍵詞： 抗素 環(huán)氧合酶-2 核因子-κB 炎癥信號(hào)途徑 C15肽　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： Resistin稱抗素(也稱FIZZ3),是一種含有114個(gè)氨基酸的細(xì)胞因子。近來(lái)發(fā)現(xiàn)resistin具有一系列前炎癥因子的特征,在炎癥中能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的表達(dá),從而導(dǎo)致白細(xì)胞向各個(gè)炎癥組織中的浸潤(rùn)。盡管resistin在炎癥發(fā)生中已有不少報(bào)道,但其與經(jīng)典炎癥信號(hào)途徑的關(guān)系,在炎癥中的作用及其調(diào)控機(jī)制尚未闡明。 環(huán)氧合酶2(COX-2)是前列腺素合成中的一個(gè)限速酶。在人體中存在兩種不同的COX異構(gòu)體,分別稱為COX-1和COX-2。其中COX-2是一種經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)而產(chǎn)生的酶,在正常生理?xiàng)l件下維持較低的表達(dá)水平,但在炎癥部位表達(dá)上調(diào),催化炎性PGs的合成并誘發(fā)炎癥反應(yīng)。此外,COX-2的啟動(dòng)子上存在NF-κB的結(jié)合元件,可受轉(zhuǎn)錄因子NF-κB調(diào)控。一些重要的炎癥因子例如TNFa和IL-1可通過(guò)激活NF-κB而上調(diào)COX-2的表達(dá)。 本研究以resistin為研究對(duì)象,采用real-time PCR、Western Blotting和細(xì)胞轉(zhuǎn)染等技術(shù),系統(tǒng)研究了resistin通過(guò)經(jīng)典的炎癥信號(hào)途徑上調(diào)COX-2的基因表達(dá)及抗炎肽C15對(duì)resistin等引起的炎癥反應(yīng)的抑制作用分子機(jī)制,結(jié)果如下： 1.在巨噬細(xì)胞內(nèi)分別轉(zhuǎn)染豬和小鼠resistin的超表達(dá)載體,采用real-timePCR和Western Blotting方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源的COX-2的mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化。結(jié)果表明,resistin在RAW264.7巨噬細(xì)胞系中可以顯著地上調(diào)COX-2的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。更重要的是,通過(guò)原核表達(dá)制備了抗resistin的抗體,用抗體處理可以抵消resistin的這種作用。 2.以巨噬細(xì)胞為模型,通過(guò)負(fù)顯性IκBα突變體和PDTC這兩種抑制物質(zhì)研究了resistin對(duì)COX-2的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控。結(jié)果表明,無(wú)論是超表達(dá)負(fù)顯性IκBα突變體載體,還是用抑制劑PDTC刺激,都可以抑制resistin對(duì)COX-2的誘導(dǎo)作用。進(jìn)一步的研究證實(shí),resistin的超表達(dá)可以上調(diào)NF-κB分子中的p65亞基的表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)COX-2的表達(dá)水平的上升。 3.以resistin對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞作不同時(shí)間梯度的處理,用Western Blotting方法分析resistin對(duì)一種MAPKKK激酶TAK1 (Transforming growth factorβactivated kinase 1)的磷酸化程度的影響。結(jié)果表明,resistin可以顯著上調(diào)TAK1的磷酸化水平。 4.以促炎物質(zhì)resistin,LPS,PA分別和C15共同處理小鼠巨噬細(xì)胞,檢測(cè)炎癥基因COX-2和iNOS (inducible nitric oxide synthase)的表達(dá)變化。結(jié)果表明,炎癥基因COX-2和iNOS可以被三種促炎物質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá),并且這種誘導(dǎo)的情況可以顯著被C15所抑制住。 5.在巨噬細(xì)胞中,以LPS在不同時(shí)間梯度刺激細(xì)胞,用細(xì)胞免疫熒光的方法檢測(cè)NF-κB的p65亞基的入核情況。結(jié)果證實(shí),C15可以明顯抑制LPS所導(dǎo)致的p65的入核情況,表明C15是通過(guò)阻止NF-κB的p65亞基入核,從而抑制相關(guān)炎癥因子的表達(dá),進(jìn)而表現(xiàn)出一定的抗炎活性。
[Abstract]:Resistin, also known as FIZZ3, is a 114 amino acid cytokine. Recently, resistin has been found to have a series of proinflammatory cytokines that induce the expression of adhesion molecules in vascular endothelial cells. Although resistin has been reported to be involved in inflammation, its relationship with the classical inflammatory signaling pathway, its role in inflammation and its regulatory mechanism have not been elucidated. Cyclooxygenase 2 (cyclooxygenase 2) is a rate-limiting enzyme in the synthesis of prostaglandins. There are two different COX isomers in the human body, called COX-1 and COX-2. COX-2 is an induced enzyme. The low expression level was maintained under normal physiological conditions, but up-regulated in inflammatory site, which catalyzed the synthesis of inflammatory PGs and induced inflammatory response. In addition, there were NF- 魏 B binding elements on the promoter of COX-2. Some important inflammatory factors such as TNFa and IL-1 can up-regulate the expression of COX-2 by activating NF- 魏 B. In this study, resistin was used to investigate the mechanism of resistin up-regulation of COX-2 gene expression through classical inflammatory signaling pathway and the inhibitory effect of anti-inflammatory peptide C15 on the inflammatory response induced by resistin by using real-time PCR Western Blotting and cell transfection techniques. The results are as follows:. 1. The superexpression vectors of porcine and mouse resistin were transfected into macrophages, respectively. The expression of mRNA and protein in endogenous COX-2 was detected by real-timePCR and Western Blotting. The results showed that the expression of mRNA and protein of COX-2 was significantly up-regulated in RAW264.7 macrophages. The antibody against resistin was prepared by prokaryotic expression, and the effect of resistin could be counteracted by antibody treatment. 2. Macrophage model was used to study the regulation of resistin signal transduction pathway in COX-2 by negative dominant I 魏 B 偽 mutants and PDTC. The results showed that both overexpression negative dominant I 魏 B 偽 mutant vector and inhibitor PDTC were used to stimulate the signal transduction pathway of COX-2. Further studies showed that the overexpression of resistin could up-regulate the expression of p65 subunit in NF- 魏 B and induce the increase of COX-2 expression. 3. The effect of resistin on the phosphorylation of a MAPKKK kinase TAK1 transforming growth factor 尾 activated kinase 1 was analyzed by Western Blotting. The results showed that resistin could significantly up-regulate the phosphorylation level of TAK1. 4. The expression of inflammatory genes COX-2 and iNOS inducible nitric oxide synthases were detected by co-treatment of mouse macrophages with proinflammatory substance resistinin-LPS-PA and C15, respectively. The results showed that the inflammatory genes COX-2 and iNOS could be induced by three kinds of proinflammatory substances. And this inducement can be significantly suppressed by C 15. 5. In macrophages, the entry of p65 subunit of NF- 魏 B was detected by cellular immunofluorescence with LPS at different time gradient. The results showed that C15 could significantly inhibit p65 entry induced by LPS. It is suggested that C15 inhibits the expression of related inflammatory factors by blocking the p65 subunit of NF- 魏 B into the nucleus and thus exhibits anti-inflammatory activity.
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：1512703